تحقیق علمی user8214- پژوهش ایرانداک

Please enter banners and links.

1-2- فرضيه ها و اهداف طرح4
فصل دوم: کلیات و بررسی منابع موجود
1-2- اشریشیا کولی5
1-1-2-خصوصیات کشت5
2-1-2-خصوصیات بیوشیمیایی6
3-1-2-انتشار و راه های انتقال اشریشیا کولی در طیور6
2-2-آنتی‌بیوتک‌ها8
1-2-2- تعریف8
2-2-2-سابقه تاریخی8
3-2-2-طبقه بندی آنتی‌بیوتیک ها9
4-2-2- استفاده از آنتی بیوتیک در حیوانات مولد غذا 10
1-4-2-2-مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها در طیور12
5-2-2- منشاء مقاومت به آنتی بیوتیک15
6-2-2- مکانیسم های مقاومت به آنتی بیوتیک15
1-6-2-2- تغییر یا جایگزینی اهداف دارو16
2-6-2-2-غیرفعالسازی آنزیمی دارو16
عنوان صفحه
3-6-2-2- پمپ‌هاي خارج كننده دارو از سلول17
4-6-2-2- کاهش جذب دارو17
5-6-2-2- حفاظت از هدف18
6-6-2-2- بدام انداختن دارو18
7-2-2- انتشار مقاومت به آنتی بیوتیک19
1-7-2-2- وراثت عمودی19
2-7-2-2- انتقال افقی20
8-2-2- مکانیسم‌های دخیل در انتقال افقی20
9-2-2- عناصر دخیل در انتقال افقی ژن های مقاومت21
1-9-2-2- پلاسمید‌ها21
2-9-2-2- ترانسپوزونها22
3-9-2-2- اینتگرون‌ها23
10-2- ساختار و ویژگی‌های اینتگرون‌ها23
1-10-2- کلاس 1 اینتگرون‌ها 24
2-10-2- کلاس 2 اینتگرون‌ها26
3-10-2- کلاس 3 اینتگرون‌ها27
4-10-2- سوپر اینتگرون‌های کروموزومی یا کلاس4 27
11-2-کاست ژنی28
1-11-2- تعریف28
2-11-2- انتقال کاست‌های ژنی29
12-2- اپیدمیولوژی اینتگرون‌ها و مروری بر شناسایی اینتگرون‌ها در ماکیان32

عنوان صفحه
فصل سوم: مواد و روش کار
1-3- مواد و وسایل مورد نیاز34
2-3- روش کار35
1-2-3- نمونه گیری35
2-2-3- آزمون های تاییدی36
3-2-3- آنتی‌بیوتیک‌های مورد استفاده برای آنتی‌بیوگرام 39
4-2-3- آزمون حساسیت آنتی بیوتیکی40
5-2-3- روش ساخت نیم مک فارلند41
6-2-3- نکات مورد توجه در انجام آزمایش آنتی بیوگرام42
7-2-3- نکات مورد توجه در اندازه گیری قطر هاله و خواندن نتایج آزمایش آنتی بیوگرام43
8-2-3- بررسی حضور مقاومت های چند گانه43
9-2-3- استخراج DNA جهت انجام آزمایشهای مولکولی 44
10-2-3- انجام واکنش های زنجیره ای پلیمراز50
11-2-3- انجام واکنش PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز 1 و 252
12-2-3- الکتروفورز روی ژل آگارز53
13-2-3- شناسایی کاست ژنی اینتگرون54
14-2-3- انجام واکنش PCR برای شناسایی کاست‌های ژنی اینتگرون کلاس 155
15-2-3- تعیین ترادف محصولات56
16-2-3- آزمون آماری56
فصل چهارم: نتایج
1-4 نتایج جستجوی اینتگرونهای کلاس 1 و 257
2-4 نتایج بررسی کاست ژنی کلاس 1 اینتگرون‌ها63
3-4 نتایج تعیین توالی کاست‌ ژنی کلاس 1 اینتگرون‌ها65
عنوان صفحه
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری67
فهرست منابع75
پیوست 89
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول1-1: طبقه بندی آنتی‌بیوتیک‌ها بر اساس مکانیسم اثر 10
جدول 1-3: دستگاهها وسائل آزمایشگاهی مورد استفاده34
جدول 2-3: مواد شیمیایی مورد استفاده35
جدول 3-3: آنتی‌بیوتیک‌های استفاده شده برای آنتی‌بیوگرام39
جدول4-3: دیسک‌های آنتی‌بیوتیک استفاده شده، مقادیر ماده موثره آن‌ها
و تفسیر نتایج آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی 41
جدول 5-3: خصوصیات روش آزمایش آنتی بیوگرام (دیسک دیفیوژن)
بر اساس معیارهای CLSI (NCCLS)42
جدول 6-3: اطلاعات نمونه های کارشده ، گرفته شده از مزارع گوشتی
شهرستان شیراز45
جدول 7-3: برنامه چرخه حرارتی PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز 1 واینتگراز 250
جدول 8-3: برنامه چرخه حرارتی PCR برای شناسایی کاست ژنی اینتگرون کلاس1 50
جدول9-3: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی ژن های
اینتگراز 1 و اینتگراز 251
جدول10-3: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی کاست ژنی
اینتگرون کلاس 151
جدول11-3: غلظت استوک مواد اولیه مورد استفاده در واکنش زنجیرهای پلیمراز51
جدول 12-3: ساخت محلول کار آماده جهت انجام Multiplex PCR برای شناسایی
ژنهای اینتگراز52
عنوان صفحه
جدول 13-3: تهیه بافر TAE 50 بار53
جدول14-3: ساخت محلول کار آماده جهت انجام PCR برای شناسایی کاست ژنی
کلاس1 اینتگرون55
جدول 1-4: مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی
بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز58
جدول 2-4: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز1 در جدایه های E. coli
جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی59
جدول 3-4: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز2 در جدایه های E. coli
جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی60
جدول 4-4: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز 1 و 2
در جدایه های E. coli جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی61
جدول 5-4: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز1 و ژن اینتگراز2 و حضور
همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه62
جدول 6-4: کد نمونه، طول کاست ژنی و ژنهای موجود در کاست ژنی
کلاس 1 اینتگرون‌ها در محصولات PCR تعیین ترادف شده66
فهرست تصاویر
عنوان صفحه
تصویر 1-1 مکانیزم های توسعه مقاومت به آنتی بیوتیک 19
تصویر 2-1 سه مکانیسم اصلی که توسط آن ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی
به صورت افقی در میان باکتری ها منتقل می‌شوند 21
تصویر3-1) ساختمان کلی یک اینتگرون 24
تصویر4-1: ساختمان کلی کلاس1 اینتگرون‌ها 25
تصویر 5-1: ساختار کلاس 1 اینتگرون‌ یافت شده در Tn40226
تصویر6-1: ساختار اینتگرون کلاس2 موجود در Tn7 26
تصویر7-1: ساختار اولین اینتگرون کلاس 3 از ژاپن 27
تصویر8-1: ساختار کاستها همراه اینتگرون 28
تصویر8-1:ساختار شماتیک کاست وارد شده به اینتگرون 29
تصویر9-1: مکانیسم ورود و بیان کاست‌های ژنی توسط اینتگرون کلاس1 31
تصویر1-4: تصوی ژل الکتروفورز63
تصویر 2-4: الگوی باند‌های محصولات PCR کاست ژنی کلاس 1 اینتگرون‌ها
با طول متفاوت پس از الکتروفورز روی ژل آگارز64
تصویر 3-4: الگوی باند‌های محصولات PCR کاست ژنی کلاس 1 اینتگرون‌ها
با طول متفاوت پس از از الکتروفورز روی ژل آگارز65
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار1-4: درصد مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی
بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز.58
نمودار 2-4: نمودار درصد موارد مثبت و منفي ژن اینتگراز 1 در جدايه هاي E. coli
بدست آمده طي مراحل مختلف نمونه‌گیری در اين مطالعه.59
نمودار 3-4: نمودار درصد موارد مثبت و منفي ژن اینتگراز 2 در جدايه هاي E. coli
بدست آمده طي مراحل مختلف نمونه‌گیری در اين مطالعه60
نمودار 4-4: نمودار درصد موارد مثبت و منفي حضور همزمان ژنهای اینتگراز 1 و 2
در جدايه هاي E. coli بدست آمده طي مراحل مختلف نمونه‌گیری در اين مطالعه61
نمودار 5-4: نمودار درصد موارد مثبت و منفي ژن اینتگراز 1 و ژن اینتگراز 2 و حضور
همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه62
فصل اول: مقدمه و هدف1-1- مقدمهکشف آنتی بیوتیک ها در اواخر دهه‌‌ی 1920 و آغاز استفاده از آنها در درمان و جلوگیری از عفونت در دهه‌ی1940 بدون شک یکی از پیشرفت‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های بزرگ پزشکی در 100 سال گذشته است (دیویس، 2007، دیویس و دیویس، 2010). از آن زمان تا کنون آنتی‌بیوتیک‌ها به طور گسترده‌ای در درمان بیماری‌های عفونی انسانها و حیوانات استفاده شده‌اند. آنتی‌بیوتیک‌ها در صنعت طیور به منظور افزایش رشد، درمان، پیشگیری و کوکسیدیواستات استفاده می‌شوند (گوآرداباسی و همکاران، 2008). استفاده گسترده از آنتی‌بیوتیک‌ها در انسان و حیوانات سبب ایجاد نگرانی‌هایی در مورد توسعه‌ی باکتری‌ های مقاوم و نیز باکتری‌های دارای مقاومت چندگانه که یک خطر بالقوه برای جوامع انسانی و حیوانات هستند، شده است، چرا که مقاومت می‌تواند سبب شکست در درمان شود (اریال، 2001).
بر طبق تخمین مرکز” کنترل و پیشگیری بیماری ها (CDC) در ایالات متحده آمریکا سالانه در حدود 60000 نفر در کشور آمریکا به علت مقاومت عوامل بیماری زا نسبت به آنتی بیوتیک ها جان خود را از دست می دهند. همچنین تخمین زده می شود که استفاده غیر درمانی از آنتی بیوتیک ها در چارپایان اهلی 80% از کل آنتی بیوتیک های استفاده شده در ایالات متحده را شامل می شود.
صنعت طیور دومین صنعت کشور ما محسوب می‌شود. با این حال به علت نبود سیستم نظارتی دقیق، آنتی‌بیوتیک‌ها به شکلی خودسرانه و غیر معقول درطیور صنعتی مصرف می‌شوند. مشکل مهمی که استفاده غیر اصولی از آنتی‌بیوتیک‌ها ایجاد می‌کند، بقایای این داروها در محصولات دامی، خصوصا گوشت ماکیان و تخم مرغ می‌باشد که علاوه بر انتقال به انسان و افزایش فشار بر کبد وکلیه‌ها برای دفع دارو، سبب ایجاد مقاومت در میکروارگانیسم‌های انسانی در اثر مواجهه آنها با این بقایای آنتی‌بیوتیکی می‌شود.
با ظهور باکتریهای مقاوم به چندین آنتی بیوتیک درمان عفونتها در سرتاسر جهان به خطر افتاده است. گرچه به صورت کلاسیک مقاومت را به جهش های کروموزومی نسبت می دهند. اما مقاومت غالبا در ارتباط با قطعات خارج کروموزومی است که از سایر باکتری‌های موجود در محیط کسب می شود که این‌ها شامل انواع مختلفی ازقطعات DNA متحرک، مثل پلاسمیدها، ترانسپوزونها و اینتگرونها هستند. به محض اینکه باکتری‌های دارای مقاومت مستقر شدند، دوام آورده و در سرتاسر جهان پخش می شوند و سبب شکست بالینی در درمان عفونتها و ایجاد بحرانهای بهداشت عمومی می‌شوند (الکسون و لوی، 2007). اینتگرونها قطعات ژنتیکی باکتریایی هستند که می توانند سبب افزایش جذب و بیان ژن ها (عموما ژنهای مقاومت) در داخل کاستهای ژنی خود شوند (استوکس و هال، 1989). اینتگرونها عموما بر اساس توالی پروتئین اینتگراز که عملکرد نوترکیبی را به آنها می‌دهد، طبقه بندی می شوند. بر اساس این توالی اینتگرونهای مقاومت (RIs ) به 5 دسته طبقه بندی شده اند ، که از میان آنها بیشترین حجم مطالعات بر روی کلاس 1 و2 و3 انجام شده است. بیش از 130 کاست ژنی مختلف شناسایی شده است که سبب ایجاد مقاومت به (تقریبا) تمام آنتی بیوتیک ها می شوند (مازل، 2006). کاست های ژنی که تا امروز در اینتگرون‌ها شناسایی شده اند معمولا فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می کنند. بنابراین به این اینتگرونها، اینتگرون‌های مقاومت (RIs ) یا اینتگرون‌های مقاومت چندگانه دارویی (MRIs )گویند (استالدر و همکاران، 2012). ژنهای مقاومت به هم پیوسته بر روی اینتگرونها (که قطعات ژنتیکی متحرک هستند) مقاومت های دارویی چندگانه را رمزگردانی می کنند و در انتقال مقاومت های دارویی چندگانه بین باکتری ها دخیل هستند (لوراستین هال و همکاران، 2003).
مواجهه با باکتریهای دارای مقاومت چندگانه از طریق زنجیره ی غذایی خطر بالقوه ای برای سلامت انسان از طریق عفونتهای منتقل شونده از راه غذا در نظر گرفته شده است. مسبب آن پاتوژن‌های مقاوم یا انتقال افقی اینتگرونها از باکتریهای موجود در حیوانات تولید کننده غذا مثل طیور به پاتوژنهای انسانی می‌باشد (باکس و همکاران، 2005). اینتگرونها در سرتاسر جهان در ارتباط با باکتری های گرم منفی توصیف شده اند و شاخصی برای مقاومت آنتی بیوتیکی هستند (باهو و همکاران، 2010).
کلاس یک اینتگرون‌ها به علت پخش وسیع در میان باکتریهای گرم منفی وبالاترین میزان گزارشات در انسان و حیوانات به طور گسترده‌ای مورد مطالعه قرار گرفته اند. این کلاس شایعترین اینتگرون در جدایه‌های کلینیکی است وسبب شده برخی نویسندگان آنها را اینتگرون‌های بالینی نامگذاری کنند (گیلینگز و همکاران، 2008). کلاس 2 اینتگرونهای متحرک ، دومین گروه فراوان اینتگرون‌ها هستند . در اغلب اینتگرونهای کلاس 2 ژن intI2 بوسیله ی یک کدون پایان منقطع می‌شود که منجر به تولید یک پروتئین ناقص و غیر عملکردی می‌شود که باعث ایجاد یک ترتیب پایدار در کاست‌های ژنی می‌شود که اساسا شامل ژن مقاومت به تری متوپریم dfrA1 ،ژن مقاومت به استرپتو تریسین sat2 ، ژن مقاومت به استرپتومیسین و اسپکتینومیسین aadA1 و ژن با عملکرد نامشخص orfX هستند (هانسون و همکاران، 2002). فشار آنتی بیوتیکی احتمالا نقش مهمی درانتخاب وپخش اینتگرونهای متحرک در باکتریها ایفا کرده است. بیش از 130 کاست ژنی که سبب مقاومت آنتی‌بیوتیکی می‌شوند و بیش از 60 کاست ژنی با عملکرد نا شناخته در رابطه با اینتگرونهای متحرک شناسایی شده اند (پارتریج و همکاران، 2009). ژنهایی که درون این کاست های ژنی جاسازی شده اند شامل ژنهای مقاومت به تقریبا تمام خانواده‌های آنتی بیوتیکی، شامل: بتا-لاکتام ها، آمینوگلیکوزیدها، تریمتوپریم، کلرآمفنیکل، فسفومیسین، ماکرولیدها، لینکوزآمیدها، ریفامپیسین و کوئینولون‌ها هستند. علاوه بر آن کاست‌های ژنیqac که فاکتورهای مقاومت به مواد ضد عفونی کننده از خانواده ترکیبات چهار تایی آمونیوم را رمزگردانی می‌کنند در اینتگرونهای متحرک یافت شده اند. مطالعات نشان داده اند که اینتگرونهای متحرک (MIs ) در جوامع باکتریایی که به طور مستقیم یا غیر مستقیم در کلینیک‌ها یا کشاورزی یا محیط در معرض فشار آنتی‌بیوتیکی قرار گرفته اند، شیوع بیشتری داشته است (استادر و همکاران، 2012).
از آن جهت که تا کنون پژوهشی در جهت شناسایی اینتگرون‌ها در باکتری‌های جدا شده از طیور گوشتی استان فارس انجام نشده و نقش آنها در ایجاد مقاومت‌های چندگانه در ماکیان استان بررسی نشده است و همچنین با توجه به نقش بسيار مهم اینتگرونها در شیوع مقاومت هاي آنتي بيوتيكي چندگانه در بين پاتوژنهای حيواني و همچنين انساني و انتقال باکتری‌های طیور از طریق زنجیره‌ی غذایی به انسان‌ها و نیز خطر انتقال فاکتورهای مقاومت از باکتری‌های ماکیان به سایر باکتری‌های موجود در محیط و باکتری‌های فلور حیوانات و انسان‌ها، به نظر مي‌رسد نتایج این پایان نامه در خصوص تعیین حضور و فراوانی اینتگرون‌ها در جدايه‌هاي اشریشیا‌کولی طیور گوشتی منطقه منجر به كسب اطلاعات مفيدي در زمينه مكانيسم‌هاي انتقال مقاومت آنتي‌بيوتيكي و ایجاد باکتری‌های دارای مقاومت چندگانه در باکتری‌های ماکیان خواهد شد.
1-2- فرضيه ها و اهداف طرحآيا اینتگرونهای کلاس 1و2 در جدایه‌های E. coli طیور گوشتی مورد مطالعه وجود دارد؟کدامیک از اینتگرونهاي کلاس 1و2 بیشترین فراوانی را در جدایه‌های موجود دارند ؟آیا میان حضور اینتگرونها و مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی در جدایه‌های مورد مطالعه ارتباطي وجود دارد ؟فصل دوم: کلیات و بررسی منابع موجود1-2- اشریشیا کولیباکتری اشریشیا کولی متعلق به جنس اشریشیا از خانواده انتروباکتریاسه می باشد. اشریشیا کولی یک باسیل گرم منفی، غیر اسیدفست، چند شکلی و غیر اسپورزا می‌باشد. اغلب سویه‌های این باکتری متحرک و دارای تاژک می‌باشند (کوئین و همکاران. 1994ب).
1-1-2-خصوصیات کشتاشریشیا کولی بصورت هوازی یا بی‌هوازی بر روی محیط کشت های معمولی و در بازه دمایی 44-18 درجه سانتی‌گراد رشد می‌کند. این باکتری بر روی پلیت‌های آگار در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در عرض 24 ساعت رشد کرده و کلنی‌های صاف، محدب و بی‌رنگی را تولید می‌کند. کلنی‌های اشریشیا کولی بر روی آگار مک کانکی صورتی درخشان، بر روی آگار EMB سبز تیره با جلای فلزی دیده می‌شوند. اگرچه شکل کلنی‌های اشریشیا کولی متغیر است ولی معمولاَ mm 3-1 قطر داشته و دارای یک ساختار گرانوله و لبه‌های کامل می‌باشند. کلنی‌های خشن، بزرگ و دارای لبه‌های منظم هستند. درحالیکه کلنی‌های موکوئیدی بزرگتر بوده و خیس وچسبنده به نظر می‌رسند. برخلاف اشریشیا کولی‌های بیماریزای پستانداران که به طور معمول بر روی آگار خون دار ایجاد همولیز می‌کنند، همولیز چهره معمول اشریشیا کولی‌های بیماریزای طیور نیست (رودریگز و همکاران 2005).
2-1-2-خصوصیات بیوشیمیاییاشریشیا کولی از تخمیر گلوکز، مالتوز، مانیتول، زیلوز، گلیسرول، رامنوز، سوربیتول وآرابینوز اسید و گاز تولید می‌کند اما دکسترین، نشاسته و اینوزیتول را تخمیر نمی‌کند. جایگزینی سوربیتول به جای لاکتوز در آگار مک کانکی برای تفریق اشریشیا کولی O157 از دیگر جدایه های اشریشیا کولی بکار می رود زیراکه O157:H7 سوربیتول را تخمیر نکرده و نمی تواند بر روی مک کانکی کلنی‌های صورتی رنگ ایجاد کند (مارچ و رتنام، 1986). اغلب جدایه‌های اشریشیا کولی لاکتوز را تخمیر می‌کنند ولی برخی سویه‌های اشریشیا کولی لاکتوز منفی وجود دارند که می بایست از سالمونلا تفریق داده شوند (بارنز و همکاران، 2008ب). اشریشیا کولی اندول تولید کرده، واکنش متیل رد مثبت داشته و نیترات را به نیتریت تبدیل می‌کند. واکنش های ووژ- پروسکوئر و اکسیداز آن منفی است و در محیط آهن دار سولفید هیدروژن تولید نمی‌کند. اشریشیا کولی در حضور سیانید پتاسیم رشد نمی‌کند. اوره را هیدرولیز کرده (اوره آز منفی است)، ژلاتین را ذوب و بر روی محیط سیترات رشد می‌کند. از آزمایش‌های بیوشیمیایی می‌توان برای تمایز اشریشیا کولی از دیگر گونه‌های جنس اشریشیا استفاده کرد (بتل هایم، 1994؛ جیلس، 1994).
3-1-2-انتشار و راه های انتقال اشریشیا کولی در طیورسروتیپ های مختلف اشریشیا کولی فلور نرمال روده بوده و در تعداد زیاد در دستگاه گوارش بسیاری از موجودات از جمله انسان دیده می‌شوند. حضور اشریشیا‌کولی در روده بسیار مفید بوده و می تواند از جایگزین شدن سایر باکتری ها مانند سالمونلا ممانعت کند (مورر و همکاران، 2002). باکتری‌های روده نقش مهمی در پاتوژنز بیماری‌های روده بازی می‌کنند، زیرا اعتقاد بر این است که آنها از روده در برابر کلونیزه شدن پاتوژنها جلوگیری می‌کنند و سبب تحریک پاسخ ایمنی در جوجه ها می‌شوند (مید، 2000). خوراک طیور می‌تواند به طور مستقیم یا غیر مستقیم از طریق تماس با خاک، جوندگان، پرندگان، گرد و غبار، انسان به عنوان حامل، فاضلاب یا آب در طول پردازش و ذخیره سازی آلوده شود. در تجزیه و تحلیل میکروبیولوژیکی مواد غذایی، اعضای انتروباکتریاسه به طور معمول به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی عمل می‌کنند و شامل باکتری‌های مهم مشترک انسان و دام مثل گونه‌های سالمونلا، گونه‌های یرسینیا و اشریشیا‌کولی هستند (میراندا و همکاران، 2008). در مطالعه‌ای به منظورجداسازی و شناسایی انتروباکتریاسه و غیر انتروباکتریاسه از دستگاه گوارش ماکیان در سطح جنس و گونه، نشان داده شد که شایع ترین انتروباکتریاسه موجود در نمونه‌ها اشریشیا کولی (33/58 %) بود (یهیا وهمکاران، 2013). در ماکیان نرمال، 15-10 درصد کلی‌فرم‌های روده‌ای ممکن است به سروتیپ های بالقوه پاتوژن تعلق داشته باشند (هری و همزلی، 1965ب). گرچه این سروتیپ‌های روده‌ای ممکن است مشابه سروتیپ‌های خارج روده‌ای بیماریزا در همان پرنده نباشند ولی می‌توانند به عنوان مخزنی برای فاکتورهای حدت و فاکتورهای مقاومت باکتریایی عمل کنند (نوگرادی و همکاران، 2006). باکتری‌های اشریشیا‌کولی‌ بیماریزا می توانند از طریق تخم مرغ منتقل شده وسبب مرگ و میر بالا در جوجه های جوان گردند (روزاریو و همکاران، 2004). کولی فرم های بیماریزا در روده جوجه‌های تازه از تخم در آمده بسیار فراوان تر از تخم مرغ هایی هستند که از آن ها تفریخ شده‌اند. این امر نشان دهنده گسترش سریع این سویه ها بلافاصله پس از تفریخ است (هری وهمزلی، 1965الف). به نظر می‌رسد که مهمترین منبع آلودگی تخم مرغ ها آلودگی مدفوعی سطح تخم مرغ ها باشد که از طریق پوسته تخم مرغ به داخل نفوذ می‌کند (بارنز و همکاران، 2008الف). دان مصرفی و سایر اجزاء جیره غذایی طیور اغلب به راحتی با کلی فرم های بیماریزا آلوده شده و منابع متداولی برای معرفی سروتیپ های جدید به گله های طیور محسوب می شوند (دا کوستا و همکاران، 2007). مدفوع جوندگان نیز محتوی سویه های بیماریزای اشریشیا‌کولی می‌باشد. دستگاه گوارش موش ها محیط مناسبی برای انتقال ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی از سویه‌های مقاوم به سویه‌های حساس است (هارت و همکاران، 2006). سروتیپ های بیماریزا ممکن است که از طریق آب چاه آلوده به گله های طیور منتقل شوند. حضور اشریشیا کولی در آب آشامیدنی نشان دهنده آلودگی مدفوعی بوده و می تواند نشانگر انتقال مدفوعی-دهانی عامل بیماریزا باشد (بارنز و همکاران، 2008الف).
2-2-آنتی‌بیوتک‌ها1-2-2- تعریفآنتی‌بیوتیک‌ها عواملی هستند که با کشتن یا مهار رشد سلول‌های باکتریایی بر آنها اثر می‌گذارند. آنها محصولات فرعی طبیعی ارگانیسم‌هایی مثل باکتری‌ها و قارچ ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ها هستند. واژه آنتی‌بیوتیک در اصل فقط آن دسته از ترکیبات مشتق شده از منشاء میکروبی را توصیف می‌کند، با این حال در حال حاضر این تعریف شامل هر ترکیب با وزن مولکولی کم می‌شود که یا از میکروب‌ها یا از سایر موجودات زنده و یا حتی از منشاء نیمه سنتزی یا مصنوعی است که می‌تواند رشد میکروارگانیسم‌های دیگر را مهار و یا آنها را نابود کند. اکثریت آنتی‌بیوتیک‌های مورد استفاده در طب انسانی و دامپزشکی محصولات طبیعی تولید شده توسط سه گروه اصلی از میکروارگانیسم ها شامل: اکتینومایست‌ها، باکتریها و قارچ های رشته‌ای، هستند. اکتینومایست‌ها بیشترین تعداد و بیشترین انواع آنتی بیوتیک‌ها را تولید می‌کنند (بیش از شش هزار ماده از آن‌ها جدا شده) (کیز وهمکاران، 2008). آنتی‌بیوتیک‌ها برای درمان بیماری و عفونت، به منظور پیشگیری در جراحی‌ها، به عنوان بهبود دهنده‌ی رشد در مزارع پرورشی، به عنوان درمان‌های پیشگیرانه در کشاورزی و برای تحقیقات در میکروبیولوژی و زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شوند (دیویس، 1990).
2-2-2-سابقه تاریخیبا ابداع پنی‌سیلین و داروهای سولفونامیدی و استفاده‌‌ی بالینی آنها به ترتیب در دهه‌ها‌ی 1930و1940 میلادی (کوهن، 2000) درمان بیماری‌های عفونی پیشرفت کرد. موفقیت بالینی این داروها و نیاز به درمان عفونت های باکتریایی در زخمهای ایجاد شده در اثر جنگ در خلال جنگ جهانی دوم منجر به کشف آنتی‌بیوتیک‌های مختلف از جمله استرپتومایسین، کلرامفنیکل، تتراسایکلین، اریترومایسین، ریفامایسین، وانکومایسین و سفالوسپورین ها بین سال های 1940و1960 شد (یونیاماتا و کاتسوماتا، 2006). تاثیر قابل توجه آنتی‌بیوتیک‌ها منجر به خوشبینی برای درمان بیماری‌های عفونی شد. اما باکتری‌ها بلافاصله پس از استفاده از هر داروی جدید مقاومت علیه آنرا ظاهر کردند وسبب ظهور مجدد عفونت‌هایی شدندکه سابقا تجربه شده بود و به نظر می‌رسید این بار بدخیم‌تر شده باشند (کوهن، 2000).
3-2-2-طبقه بندی آنتی‌بیوتیک هادسته‌های متفاوتی از آنتی‌بیوتیک‌ها وجود دارند که هر کدام قسمت متفاوتی از سیستم رشد سلول باکتری را هدف قرار می‌دهند. این مواد یا باکتریواستاتیک یا باکتریوسیدال هستند. بتا-لاکتام‌ها و سفالوسپورین‌ها آنتی‌بیوتیک‌های باکتریوسیدال هستند که سنتز دیواره سلولی را مهار می‌کنند (تیورتزباکر، 1998). آنها سبب غیر فعال شدن پروتئین‌های باند‌شونده به پنی‌سیلین می‌شوند که این پروتئین‌ها، آنزیم‌هایی هستند که در اتصالات عرضی پپتیدوگلیکان دخیل هستند. این آنتی‌بیوتیک‌ها فقط سلول‌های در حال رشد را می‌کشند. تتراسایکلین ها عوامل باکتریواستاتیکی هستند که با اتصال به زیرواحد 30S ریبوزومی ومهار اتصال tRNAحامل اسید‌آمینه مانع از سنتز پروتئین می‌شوند (تیلور و چاو، 1996). آمینوگلیکوزیدها دسته‌ای از آنتی‌بیوتیک‌ها با طیف گسترده‌ای از اعضاء هستند که با اتصال به زیرواحد 30S ریبوزومی و ایجاد اشتباه در خواندن mRNA سنتز پروتئین را مهار می‌کنند (رکیا و هال، 1995ب). کینولون ها، عوامل ضد میکروبی باکتریوسیدال هستند که از طریق تعامل با DNA gyrase و توپوایزومراز، سبب مهار فعالیت آنزیمی و مهار باز شدن رشته‌های در هم پیچیده DNA شده و همانند‌سازی DNA را مهار می‌کنند (هوپر، 1999). کلرامفنیکل با اتصال به زیرواحد 50S ریبوزومی و اثر مهاری بر peptidyltransferase دارد سبب مهار سنتز پروتئین می‌شود (موری و شاو، 1997).
طبقه‌ بندی آنتی‌بیوتیک‌ها بر اساس مکانیسم اثر به طور خلاصه در جدول زیر آورده شده است.
جدول1-1: طبقه بندی آنتی‌بیوتیک‌ها بر اساس مکانیسم اثر (طبقه بندی آنتی‌بیوتیک‌ها و مکانیسم عمل آنها، 2013)
Antibiotic Grouping By Mechanism
Cell Wall Synthesis PenicillinsCephalosporinsVancomycinBeta-lactamase InhibitorsCarbapenemsAztreonamPolymycinBacitracin
Protein Synthesis Inhibitors Inhibit 30s SubunitAminoglycosides (gentamicin)TetracyclinesInhibit 50s SubunitMacrolidesChloramphenicolClindamycinLinezolid Streptogramins
DNA Synthesis Inhibitors Fluoroquinolones 
RNA synthesis Inhibitors Rifampin
Mycolic Acid synthesis inhibitors Isoniazid
Folic Acid synthesis inhibitors Sulfo–esTrimethoprim
4-2-2- استفاده از آنتی بیوتیک در حیوانات مولد غذا
استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در حیوانات مولد غذا مدت کوتاهی پس از جنگ جهانی دوم آغاز شد. مور و همکاران پیشنهاد کردند که آنتی‌بیوتیک‌ها در آب و غذای حیوانات استفاده شوند، زیرا به نظر می‌رسید آنها سرعت رشد ماکیان را ارتقا می بخشند (مور و همکاران، 1946). از آن زمان، پژوهش‌های بعدی به گزارش مزایای دوزهای تحت درمانی آنتی‌بیوتیک‌ها (که توسط سازمان غذا و داروی آمریکا کمتر از 200 گرم در هر تن غذا معین شده) که در حیوانات متفاوت از جمله خوک وگاو آزمایش شده بود، پرداخت (کانها و همکاران، 1950؛ لوسلی و والاس، 1950؛ پرسکات، 2006). این مکانیسم که چگونه آنتی‌بیوتیک‌ها سبب بهبود سرعت رشد و بازده خوراک می‌شوند هرگز به خوبی درک نشده است. با این حال نظریه‌های متعددی پیشنهاد شده است از جمله: 1) اثرات بیوشیمیایی که شامل دفع نیتروژن، افزایش بهره وری وراندمان در فسفوریلاسیون سلولها و سنتز پروتئین 2) اثرات آنتی‌بیوتیک‌ها روی تولید ویتامین‌ها وکوفاکتورهای ضروری توسط میکروفلور روده و 3) کاهش در جمعیت ارگانیسم‌های بیماریزای تحت بالینی (کرامول، 1991). همچنین استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها سبب کاهش تولید کود و در نتیجه کاهش اثرات ضایعات حیوانی بر محیط زیست شده (راث و کرشجسنر، 1993) و کاهش بار پاتوژن حیوانات و کاهش حمل پاتوژن های منتقله از طریق غذا در دام‌ها را سبب می‌شود (ابنر و متیو، 2000؛ کریاکیس و همکاران، 1996). بسیاری از پاتوژن های منتقل شده از طریق غذا به راحتی با واکسیناسیون در دام‌ها قابل کنترل نیست و چون این موجودات ارتباط همسفرگی با میزبان خود (حیوانات مولد غذا) دارند ریشه‌کن کردن آنها اگر غیرممکن نباشد، دشوار است. با این حال، محدود کردن تعداد آنها در روده با غذاهای مبتنی برآنتی بیوتیک ها یا افزودن آنتی‌بیوتیک‌ها به صورت مکمل های آب ممکن است یک رویکرد عملی برای محدود کردن انتقال این ارگانیسم ها‌ی قابل انتقال با غذا باشد (فیلیپس و همکاران، 2004). در دامداری، استفاده از آنتی‌بیوتیک به 4 هدف انجام می‌شود (شوارتز و چاسلوس-دانکلا، 2001) در مرحله اول، درمانی است که در نظر دارد عفونت باکتریایی موجود را با درمان حیوانات آلوده کنترل کند. دوم، اقدام درمانی که هدف آن درمان حیوانات آلوده و همچنین دارو دادن به حیوانات دیگر برای هدف پیشگیری است. سوم، درمان پیشگیری است که در طول دوره خطر بالای سرایت عفونت به عنوان یک اقدام پیشگیرانه اعمال می شود اما حیوانات بیمار را درمان نمی‌کنند (مثلا هنگام جابجایی یا از شیرگیری دام). و در نهایت، استفاده از عوامل آنتی بیوتیکی برای هدف ارتقاء رشد.
تتراسایکلین، پنی سیلین، اریترومایسین و سایر داروهای مورد استفاده در طب انسانی به طور گسترده در پرورش حیوانات مولد غذا استفاده می‌شوند. یک مطالعه که توسط دانشمندان در سال 2001 منتشر شد بیان کرد که حدود 6/24 میلیون پوند آنتی‌بیوتیک در حیوانات استفاده می‌شود، که بخش عمده آن مربوط به استفاده آنها در تولید ماکیان است که از دهه‌ی 1980 افزایش چشمگیر 307 درصدی داشته است. برآوردهای آنها عنوان کرد که استفاده‌ی غیر درمانی در دامها 70 درصد کل استفاده آنتی‌بیوتیکی را شامل می‌شود (ملون و همکاران، 2001). آمار و ارقام بدست آمده درمطالعه‌ی این دانشمندان بر اساس روشهای غیر مستقیم و تعمیم دهی بوده است و برآورد میزان دقیق آنتی‌بیوتیک‌ها برای حیوانات هنوز هم نیاز به روشن کردن این نکته دارد که داروها برای چه منظور و در چه مقدار استفاده می شود.
1-4-2-2-مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها در طیوربه طور کلی آنتی بیوتیک ها در صنعت طیور برای اهداف درمانی، غیردرمانی و ارتقاء رشد استفاده می‌شود (سی وی پی، 2006؛ لو و همکاران، 2006)
امروزه تولید جوجه های گوشتی بسیار نظام‌مند و متراکم شده است. این ادغام منجر به نیاز به شیوه های استاندارد از جمله روش های درمان دارویی برای به حداقل رساندن عفونت در میان گله شده است. آنتی‌بیوتیکها معمولا از طریق آب و غذا به کل گله ماکیان تجویز می‌شود چرا که درمان‌های فردی عملی نیست. برای مثال، آنتی بیوتیک‌هایی از قبیل یونوفورها و سولفونامیدها که برای کنترل کوکسیدیوز (یک بیماری انگلی که بوسیله‌ی تک یاخته کوکسیدیا ایجاد می‌شود) استفاده می شوند در جیره جوجه های گوشتی موجود می‌باشد. باسیتراسین، کلرتتراسایکلین، پنی سیلین، ویرجینیامایسین و ترکیبات آرسنیک در جهت ارتقاء رشد و بازده خوراک در جوجه های گوشتی، بوقلمون ها، و طیور تخمگذار تایید شده‌اند (ان آر سی، 1999). تولید مرغ گوشتی تقریبا همیشه شامل مصرف یک کوکسیدیواستات، ترکیب آرسنیکی و یک آنتی بیوتیک برای بهبود بازده خوراک و افزایش وزن بدن و کاهش عوارض و مرگ و میر می‌باشد (ان آر سی، 1999). آنتی بیوتیک های محرک رشد مورد استفاده در تولید طیور در ایالات متحده شامل کلرتتراسایکلین، باسیتراسین، تایلوزین، بامبرمایسین و ویرجینیامایسین می‌باشد (سی وی پی،2006). بیماری های باکتریایی، از جمله کلی‌باسیلوز، انتریت ناشی از گونه‌های کلستریدیوم، مایکوپلاسموزیس، و انواع مختلفی از سالمونلوز، باعث ضررهای اقتصادی قابل توجهی به صنعت طیور می‌شوند (بارنز و همکاران، 2008ب) و دلیل اصلی برای درمان آنتی‌بیوتیکی در طیور هستند (سینگر و هوفکر،2006) آنتی بیوتیک های متداول مورد استفاده برای کنترل این ارگانیسم‌ها شامل سولفونامیدها، آموکسی سیلین، تتراسیکلین، ویرجینیامایسین، تایلوزین، نئومایسین، و پنی سیلین هستند. تا همین اواخر، انروفلوکساسین، داروی فلوروکینولونی، برای کنترل کلی‌باسیلوز مورد تائید بود. با این حال، نگرانی در مورد اینکه استفاده از فلوروکینولون‌ها در طیور ممکن است با عفونت کمپیلوباکتر مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک در انسان مرتبط باشد (پیداک، 1995؛ مورفی و همکاران،1996؛ چو و همکاران،2004) سبب شد سازمان غذا و داروی آمریکا در سال 2005 استفاده از این دارو را در طیور ممنوع کند (اف دی آ، 2005). تخم مرغ‌های نطفه‌دار نیز ممکن است برای کاهش آلودگی به مایکوپلاسما و باکتری‌ها در جنتامایسین غوطه ور شوند (مک یووین و فدورکا-کری، 2002).
پیامدهای استفاده از آنتی بیوتیک ها در حیوانات مولد غذامطالعات نشان می‌دهد آنتی‌بیوتیک‌هایی که در حیوانات مولد غذا استفاده می شوند باکتری‌های مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک همزیست، از جمله انتروکوکوس و اشریشیا‌کولی غیرپاتوژن و عوامل آنتروپاتوژن‌های مشترک انسان و دام مانند سالمونلا، کامپیلوباکتر، یرسینیا و اشریشیا‌کولی پاتوژن را انتخاب می‌کند (لینتون و همکاران 1975؛ لوی و همکاران، 1976؛ انتز وهمکاران، 1991؛ لو و همکاران،1997). در هر حال، آنتی بیوتیک های مورد استفاده در حیوانات مولد غذا فشار انتخابی را فراهم می‌کند که باکتری‌ها را وادار به توسعه‌ی مکانیسم‌های مقاومت کرده و آشکارا به انتشار مقاومت آنتی بیوتیکی در میان باکتری ها کمک می‌کند.
از آنجا که بسیاری از آنتی بیوتیک های مورد استفاده در حیوانات مولد غذا متعلق به گروههایی از آنتی بیوتیکها هستند که در طب انسانی مورد استفاده قرار می گیرد، ظهور باکتریهای مقاوم به آنتی‌بیوتیک، به نگرانی ویژه ای در سلامت مواد غذایی تبدیل شده است (شی، 2003). سویه های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک آنتروپاتوژن های مشترک انسان و دام و همچنین سویه‌های همزیست به احتمال زیاد از طریق زنجیره غذایی به انسان منتقل می‌شوند. هولمبرگ وهمکاران در سال 1984 گزارش کردند که عفونت سالمونلایی با مصرف همبرگر آلوده به سالمونلا انتریکا سرووار نیوپورت مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک‌های آمپی سیلین، کاربنیسیلین، و تتراسایکلین، ارتباط داشت. منشاء پاتوژن‌های مسبب به گوشت گاوهایی در داکوتای جنوبی برمی‌گشت که با دوز تحت درمانی از کلرتتراسایکلین به عنوان محرک رشد تغذیه شده بودند. درمان آنتی بیوتیکی در طول کلونیزه شدن باکتریهای مقاوم به آنتی بیوتیک، ممکن است سبب پیشرفت به حالت بیماری بالینی شود. اثرات انتخابی ارائه شده توسط آنتی بیوتیک های تجویز شده در درمان دارویی، یک مزیت خاص برای برخی از پاتوژن‌های مقاوم ایجاد می‌کند تا رشد بیشتری نسبت به میکروفلور دستگاه گوارش داشته باشند (هملمبرگ و همکاران، 1984). در سال 2001 در هلند نسبت باکتری‌های اشریشیا‌کولی مدفوعی مقاوم در طیورگوشتی و بوقلمون و مرغان تخم گذار که به جیره آنها آنتی بیوتیک اضافه شده بود و درنمونه‌های مدفوعی پرورش دهندگان طیور گوشتی، بوقلمون و مرغان تخم گذار وکشتار کنندگان طیور گوشتی و بوقلمون تعیین شد که نتایج آن حاکی ازانتقال مقاومت از طیور به انسان بودند (ون دن بوگارد و همکاران، 2001). مواجهه با باکتریهای دارای مقاومت چندگانه از طریق زنجیره ی غذایی خطر بالقوه ای برای سلامت انسان از راه عفونتهای منتقل شونده از غذا در نظر گرفته شده که یا پاتوژن های مقاوم یا انتقال افقی اینتگرون‌ها از باکتری‌های موجود در حیوانات تولید کننده غذا ) food-producing animals مثل طیور) به پاتوژنهای انسانی مسبب آن است (باکس و همکاران، 2005).
افزایش سطح مقاومت باکتریایی درمان آنتی بیوتیکی را کمتر موثر می سازد. شکست درمان به علت افزایش مقاومت سالمونلا به فلوروکینولون‌ها مانند سیپروفلوکساسین و نالیدیکسیک اسید از دهه‌ی1990 گزارش شده است (موری و همکاران، 2005). درمان عفونت ایجاد شده با سویه‌های باکتریایی مقاوم در برابر آنتی بیوتیک با توجه به انتخاب محدود درمانی پس از تشخیص و افزایش حدت سویه‌های دارای مقاومت آنتی بیوتیکی، سخت تر می شوند (مالباک، 2006)
باکتری های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک با منشاء حیوانی می تواند سبب بیماری‌های جدی در انسان وشکست در درمان دارویی هم در دامپزشکی وهم در طب انسانی شود، بنابراین استفاده محتاطانه‌تر از آنتی‌بیوتیک‌ها برای کنترل ظهور و گسترش پاتوژن های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک مورد نیاز است.
انتقال باکتری‌های حامل ژنهای مقاومت از طریق غذا محتمل‌ترین راهی است که از طریق آن استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در کشاورزی می تواند بر سلامت انسان تاثیر گذارد. با این حال، برخی از شواهد برای انتقال مستقیم باکتری های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک از حیوانات به انسان گزارش شده است (هومل و همکاران، 1986؛ هانتر و همکاران،1994؛ باکس و همکاران،2005؛ جانسون و همکاران، 2007).
بنابراین انتقال ژنهای مقاومت واینتگرونها ی حاوی مقاومت های چندگانه که دراثر مصرف بی رویه آنتی بیوتیکها ایجاد شده اند، ازباکتریهای فلور به انواع پاتوژن، خطر بالقوه ای برای سلامت ماکیان محسوب می شودکه از طریق بی اثر کردن آنتی بیوتیکهای موجود باعث تحمیل هزینه های درمانی زیاد به مرغداران و افزایش تلفات ماکیان شده که منجر به بالا رفتن قیمت نهایی مرغ شده و می تواند سبب خسارات جدی به صنعت طیور و آسیب به چرخه ی اقتصادی کشور شود، همچنین خطر بهداشت عمومی و انتقال این ژنها به پاتوژنهای انسانی، درمان عفونتهای انسانی را باشکست مواجه خواهد کرد وسبب بی اثر شدن طیف وسیعی از آنتی بیوتیکهای موثر جدید و رایج می شود.5-2-2- منشاء مقاومت به آنتی بیوتیکاین موضوع به خوبی شناخته شده است که تعدادی از گونه های باکتریایی و قارچی دارای توانایی تولید ترکیبات آنتی بیوتیک هستند که به طور معمول برای به دست آوردن مزیت رقابت در محیط های غنی از میکروارگانیسم، از جمله خاک و بیوفیلم می‌باشد (آمابیلی-کوئواس و شیکیورل، 1992). پس این احتمال وجود دارد که آنتی بیوتیک‌های طبیعی بسیار پیش از آنکه اولین عوامل آنتی بیوتیکی به استفاده بالینی معرفی شوند در محیط زیست موجود بوده‌اند (شوارتز و چاسلوس-دانکلا، 2001). مقاومت آنتی بیوتیکی نیز به احتمال زیاد در طبیعت قبل از استفاده انسان از مواد دارویی، پدید آمده است، زیرا ارگانیسم های تولیدکننده ترکیبات آنتی‌بیوتیکی نیاز به وسیله‌ای برای زنده ماندن در حضور محصولات خود داشتند، و گونه های رقیب نیز راه هایی برای مقابله با اثرات این ترکیبات یافتند (دیویس، 1997). بنابراین، برخی از ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی به احتمال زیاد بسیار پیش از ظهور انسان، طب مدرن، و استفاده از آنتی‌بیوتیک ها در کشاورزی بوجود آمده‌اند.
6-2-2- مکانیسم های مقاومت به آنتی بیوتیکدو مورد از رایجترین معیارهای مورد استفاده برای توصیف مقاومت آنتی بیوتیکی بر اساس فاکتورهای میکروبیولوژیکی (مقاومت آزمایشگاهی) و بالینی (مقاومت در بدن) استوار است (گوارداباسی و کوروالین، 2006). برای تعریف میکروبیولوژیکی، سویه‌ای به عنوان مقاوم تعریف شده که دیگر توسط حداقل غلظت مهاری آن آنتی بیوتیک که مانع از رشد سویه های معمولی آن گونه می‌شود، مهار نشود (گرین وود، 1995) با این حال، برای تعاریف بالینی، سویه‌ای به عنوان مقاوم تعریف می‌شود که تحت درمان دارویی، زنده باقی بماند (گوارداباسی و کوروالین، 2006). اما به طور معمول مراد از مقاومت نوع آزمایشگاهی آن بوده و ملاک ما هم در این پایان نامه بر مبنای آن است زیرا نوع بالینی آن به فاکتورهای متعددی از قبیل دوزاژ، نحوه تجویز، توزیع بافتی دارو و وضعیت ایمنی بیمار بستگی دارد.
سلول های باکتریایی با استفاده از مکانیسم های مختلفی در برابر اثرات آنتی بیوتیک ها مقاومت می‌کنند. مقاومت به داروهای ضد میکروبی در باکتری ها می تواند ذاتی به دلیل مکانیسم عمل دارو یا اکتسابی باشد. حالت اکتسابی نوعی است که می تواند انتشار یابد و باعث افزایش مشکلاتی شود که امروزه جامعه پزشکی با آن مواجه است (رایس و بونومو، 2005).
رایجترین مکانیسم های مقاومت عبارتند از:
1-6-2-2- تغییر یا جایگزینی اهداف داروبا تغییر یا جایگزینی گیرنده هدف، آنتی بیوتیک دیگر متصل نمی شود و به همین دلیل اثر مد نظر را ندارد. این روش تقریبا برای مکانیسم های مقاومت تمام گروههای آنتی بیوتیکی مرتبط است. تاکنون آشکار شده است که این راه برای مقاومت به پنی سیلین، گلیکولیپیدها، ماکرولیدها، لینکوزآمیدها، واسترپتوگرامین‌ها (MLS) در باکتری‌های گرم مثبت، و برای مقاومت به کینولون ها در هر دوگروه باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، حائز اهمیت است. متیلاسیون هدف دارو، جهش ریبوزوم (برای مقاومت در برابر آمینوگلیکوزید و MLS) و جهش ژن مربوط به آنزیم باکتریایی که دارو آنرا هدف قرار داده است در مورد مقاومت به کینولون نمونه هایی از تغییر هدف هستند. مقاومت به گلیکوپپتیدها در انتروکوکسی‌ها و مقاومت به متی‌سیلین در استافیلوکوکوس اورئوس نمونه‌هایی از جایگزینی هدف دارو با یک ترکیب با میل ترکیبی کمتر است (گوارداباسی و کوروالین، 2006)
2-6-2-2-غیرفعالسازی آنزیمی داروغیر فعال سازی آنزیمی مکانیزم اصلی است که باکتری برای فرار از اثر بتا-لاکتام‌ها، آمینوگلیکوزیدها، و فنیکل‌ها استفاده می‌کند. اگرچه شایع نیست، اما معلوم شده که این مکانیسم‌ها در مقاومت به تتراسایکلین، MLS و فسفومایسین دخیل هستند. آنزیم ها می‌توانند جایگاه فعال دارو را توسط شکستن مولکول دارو یا اضافه کردن گروه های شیمیایی که از از اتصال دارو به سایت هدف خود جلوگیری می‌کند و سبب از دست دادن توانایی آنتی‌باکتریال دارو می‌شود، تغییر دهند. مهم ترین آنزیم‌های غیر فعال کننده داروها عبارتند از: بتا-لاکتاماز و آنزیم‌های تغییردهنده‌ی آمینوگلیکوزید‌ها. بتا-لاکتاماز، آنتی بیوتیک های بتالاکتام را قبل از رسیدن به محل هدف در باکتری از بین می‌برند و از اتصال آن به سایت هدف جلوگیری می‌کنند. آنزیم‌های تغییردهنده‌ی آمینوگلیکوزید‌ها عمل خود را توسط تسریع انتقال گروه استیل به گروه های آمین یا گروه‌های فسفریل یا نوکلئوتید‌ها به گروه‌های آمین یا هیدروکسیل در مولکول آمینوگلیکوزید انجام می‌دهند که منجر به اتصال ضعیف این دارو به ریبوزوم می‌شوند (ساندایاناکا و پراشاد، 2002؛ بابیک و همکاران،2006؛ گوارداباسی و کوروالین، 2006).
3-6-2-2- پمپ‌هاي خارج كننده دارو از سلولسیستم‌های خروج دارو از سلول با پمپاژ فعال مولکول های آنتی‌بیوتیک به خارج، از تجمع داخل سلولی آن جلوگیری می‌کنند، زیرا این تجمع برای اعمال فعالیت های کشنده آنتی‌بیوتیک ضروری است. پمپ‌هاي خارج كننده دارو از سلول مکانیسم های وابسته به انرژی هستند. این پمپ ها ممکن است برای یک سوبسترا اختصاصی باشند (پمپ های مقاومت مخصوص دارو) و یا ممکن است طیف وسیعی از ترکیبات ساختاری غیر مشابه، از جمله آنتی‌بیوتیک‌های چندین کلاس و دسته را انتقال دهند که موجب مقاومت دارویی چندگانه شود (پمپ های مقاومت دارویی چندگانه). پمپ های مقاومت مخصوص دارو مهمترین مکانیزم مقاومت به تتراسایکلین هستند. این پمپ ها به طور کلی سطح بالایی از مقاومت را ایجاد می‌کنند و عمدتا با عناصر ژنتیکی متحرک در ارتباط هستند. پمپ های مقاومت دارویی چندگانه ممکن است چند سوبسترا داشته باشد، با این حال این پمپ ها به طور کلی سطح پایینی از مقاومت را ایجاد کرده و معمولا بر روی کروموزوم کد گذاری شده‌اند (کوهلر و همکاران، 1999؛ وبر و پیداک، 2003؛ گوارداباسی و کوروالین، 2006)
4-6-2-2- کاهش جذب داروکاهش جذب دارو یکی دیگر از مکانیسم های باکتری‌ها است که به منظور کاهش غلظت داروهای در حال تجمع در سلول، استفاده می‌کنند. این امر ممکن است از طریق مکانیسم‌های متعددی از جمله کاهش نفوذپذیری غشای خارجی رخ دهد، همانطور که در سودوموناس آئروژینوزا و E. coli O157:H7 ، جهش پورین(لوله‌های پروتئینی توخالی بتا که از دیواره سلولی عبور کرده و به عنوان یک روزنه عمل می‌کنند که مولکول‌ها از طریق آن می‌توانند انتشار یابند) منجر به از دست دادن، اندازه کوچک، و یا کاهش بیان پروتئین‌های پورین می‌شود، ویا کاهش بیان پورین OmpF که نشان داده شده است سبب افزایش مقاومت باکتری E. coli به کینولون ها، بتا-لاکتام‌ها، تتراسایکلین و کلرامفنیکل می‌شود. فقدان یک شیب پتانسیل الکتریکی که برای بردن داروها از یک سوی به سوی دیگر غشاء باکتری لازم است، همانطور که در مورد مقاومت در برابر آمینوگلیکوزیدها هم اختلال در این امر سبب کاهش جذب دارو توسط باکتری ها می‌‌شود (میتس و همکاران، 1982؛ آیزنبرگ و همکاران، 1984؛ گوارداباسی و کوروالین، 2006).
5-6-2-2- حفاظت از هدفگزارش شده است که حفاظت از هدف در مقاومت به تتراسایکلین‌ها و کینولون ها نقش دارد. مقاومت در برابر تتراسایکلین ها توسط این مکانیسم از حضور پروتئین‌های حفاظت ریبوزومی ناشی می‌شود. حداقل هشت پروتئین حفاظت ریبوزومی یافت شده است که با مقاومت در برابر تتراسایکلین مرتبط بوده‌اند. در میان آنها، Tet(M) و Tet(O) شایع ترین هستند و به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. حضور یک پروتئین حفاظت کننده از DNA gyrase در مقاومت در برابر کینولون‌ها در انتروباکتریاسه گزارش شده شده است (کانل و همکاران، 2003؛ ترن و همکاران، 2005؛ گوارداباسی و کوروالین، 2006؛ گوئیمند و همکاران، 2006؛ کوبایاشی و همکاران، 2007).
6-6-2-2- بدام انداختن داروباکتری می تواند دارو را با تولید بیش از حد هدف آن، یا مولکول های دیگری که میل ترکیبی بالایی برای داروی مورد نظر دارد آنرا به دام اندازد. تولید بیش از حد اهداف سولفونامیدها، دی‌آمینوپیریمیدین‌ها، در چندین گونه باکتری گزارش شده است. نشان داده شده است که یک جهش، منجر به دیواره سلولی ضخیم تر با محل‌های اتصال بسیار برای وانکومایسین، سبب به دام انداختن مولکول های آنتی بیوتیک شده که بدان وسیله تعداد مولکول های وانکومایسین را که به غشای سیتوپلاسمی (جایی که اهداف ترانسگلیکوزیلاز در آن قرار دارد) می‌رسند کاهش می‌دهد (کوی و همکاران، 2003؛ باگسیجیل و همکاران، 2007).

تصویر 1-1 مکانیزم های توسعه مقاومت به آنتی بیوتیک A) تغییر هدف B) حفاظت از هدف C) بدام انداختن دارو D) غیرفعالسازی آنزیمی دارو E) کاهش جذب دارو F) پمپ‌هاي خارج كننده دارو از سلول (گوارداباسی و کوروالین، 2006)
7-2-2- انتشار مقاومت به آنتی بیوتیکبسیاری از مکانیزم های مختلف مقاومت به آنتی بیوتیکها بین باکتری ها به طریقه‌های گوناگون منتشر می شوند که بسته به آن که آیا آن مکانیزم‌ها در DNA کروموزومی و یا خارج کروموزومی واقع شده‌اند عبارتند از:
1-7-2-2- وراثت عمودیمقاومت ناشی از جهش های کروموزومی بوسیله‌ی تکرار در تقسیم سلولی. همیشه به صورت عمودی به نسل بعد منتقل می‌شود. همچنین مکانیسم های دیگری نیز مانند پروتئین های القایی می تواند توسط ژنهای‌کروموزومی رمزگردانی شده و به این ترتیب بوسیله‌ی وراثت عمودی در میان باکتری ها منتقل شود (رایس و بونومو، 2005).
2-7-2-2- انتقال افقیانتقال افقی مقاومت تا حد زیادی بین باکتری های یک گونه یا گونه های مختلف رخ می‌دهد. اغلب بیش از یک ژن مقاومت روی یک عنصر قابل انتقال واقع شده و بنابراین مقاومت به بسیاری از آنتی بیوتیک های مختلف می تواند از لحاظ ژنتیکی مرتبط باشد. این به این معنی است که استفاده از یکی از این آنتی بیوتیک ها می تواند سبب انتخاب همزمان مقاومت به بسیاری از انواع دیگر از آنتی بیوتیک‌ها شود. هنگامی که این عناصر بین باکتری های منتشر می‌شود، انتشار مقاومت در برابر بسیاری از انواع آنتی بیوتیک ها به صورت همزمان رخ می‌دهد.
8-2-2- مکانیسم‌های دخیل در انتقال افقیکسب ژنهای مقاومت‌های به روش انتقال افقی عمدتا از طریق سه مکانیزم مختلف رخ می‌دهد که شامل : ترانسفورماسیون، ترانسداکسیون و کنژوگاسیون است.ترانسفورماسیون به معنای جذب DNA آزاد از سلولهای باکتری لیز شده در محیط مجاور آن می‌باشد. هنگامی که عوامل تعیین کننده مقاومت با این مکانیسم گرفته شد آنها می‌توانند بوسیله‌ی نوترکیبی هومولوگ وارد کروموزوم باکتریایی شوند که منجر به آرایش موزاییکی جدید ژن‌ها می شود.ترانسداکسیون، انتقال DNA باکتریایی با واسطه باکتریوفاژ است و معمولا برای انتشار موثر و کارآمد ژن مقاومت چندان مهم و مطرح نمی‌باشد. فاژهایی که وارد کروموزوم باکتریایی شده‌اند، زمان خروج و بسته‌بندی در کپسول می‌توانند یک بخش از DNAباکتری راکه در مجاور آنها بوده است، با خود حمل کرده و متعاقب آن به سلول باکتری بعدی که توسط ویروس (فاژ) آلوده شده، منتقل می شود. کپسول همچنین می تواند شامل DNA نامربوط مانند پلاسمیدها کوچک و یا تکه های DNA باشد و سبب گسترش بیشتر آنها شود، این سناریویی است که برای فاژهایی که وارد DNA باکتری میزبان نشده‌اند صادق ‌می‌باشد.کنژوگاسیون مهم ترین مکانیسم برای انتقال افقی محسوب می‌شود، که تبادل DNA زمانی رخ می‌دهد که سلول های دهنده و گیرنده در تماس مستقیم با یکدیگر باشند (رایس و بونومو، 2005).
تصویر 2-1 سه مکانیسم اصلی که توسط آن ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی به صورت افقی در میان باکتری ها منتقل می‌شوند. A) ترانسداکسیون B) ترانسفورماسیون C) کنژوگاسیون (لیامتانگ، 2008)
9-2-2- عناصر دخیل در انتقال افقی ژن های مقاومتپلاسمیدها، ترانسپوزونها، اینتگرون‌ها / کاست‌های ژنی، و جزایر ژنومی کروموزومی، نقش مهمی در انتقال افقی ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی بازی می‌کنند (شوارتز و چاسلوس-دانکلا، 2001). این چهار نوع عنصر از DNA دو رشته تشکیل شده‌اند اما بطورواضحی در اندازه، ساختار، خواص بیولوژیکی و همچنین مکانیسم های گسترش، تفاوت دارند (شوارتز و همکاران، 2006)
1-9-2-2- پلاسمید‌هاناقل رایج برای انتقال ژنهای مقاومت است، پلاسمید‌ها خارج کروموزومی، و غالبا مولکولهای DNA حلقوی هستند. پلاسمیدها حاوی ژن های هستند که برای بقای باکتری ضروری نیست، اما اغلب برای باکتری ها مفید است برای مثال حاوی ژنهای مقاومت و ژنهایی که عملکرد متابولیکی و عوامل حدت را رمزگردانی می‌کنند، هستند. این عناصر مکانیسم های تکثیر خود را حمل می‌کنند و بنابراین می توانند به تعداد زیاد در سلول باکتری وجود داشته باشند. پلاسمیدهای کوچک، با اندازه‌‌ی حدود 3 کیلوباز شناخته شده‌اند که در بیش از 20 نسخه در یک سلول وجود دارند و در نتیجه در سویه باکتریایی میزبان بسیار پایدار هستند. از سوی دیگر پلاسمیدهای بزرگ که اندازه‌ای تا 180 کیلو باز دارند، غالبا تنها در یک نسخه وجود دارند اما اغلب حامل ژنهای خاص برای پارتیشن بندی خود در سلولهای در حال تقسیم هستند تا اطمینان حاصل شود که هر سلول جدید یک کپی از پلاسمید را دارد. باکتری ها گاهی اوقات چندین پلاسمید مختلف حمل می‌کنند که می تواند شامل ژنهای مقاومت های مختلف بسیاری باشد. همه انواع پلاسمیدها نمی‌توانند در یک سلول باکتریایی همزیستی داشته باشند، این امر سبب تقسیم پلاسمیدها به گروه های ناسازگار می‌شود. مکانیسم اصلی انتقال پلاسمیدها کونژوگاسیون است. حداقل 33 کیلوباز برای انتقال ژنها بواسطه‌ی کونژوگاسیون نیاز است. محدوده‌ی پلاسمیدهای گوناگون میزبان متنوع و بی‌ثبات است، در حالی که برخی فقط دریک گونه انتشار می‌یابند بقیه می‌توانند به طیف گسترده ای از میزبان ها منتقل شده و در نتیجه فاکتورهای مقاومت را بین گونه های مختلف مهم، گسترش دهند (رایس و همکاران، 2003؛ رایس و بونومو، 2005)
2-9-2-2- ترانسپوزونهاعلاوه بر فاکتور‌های مقاومت یا‌ ژنهای دیگر، ترانسپوزونها عناصری هستند که ژنهایی را حمل می‌کنند که سبب جابجایی خودشان، مستقل از نوترکیبی میزبان، می‌شود. ورود ترانسپوزونها گاهی اوقات، مثلا در مورد Tn7، خاص یک جایگاه است اما غالبا در طیف گسترده ای از زمینه ها، هم در پلاسمید و هم درDNA کروموزومی وارد می‌شوند. از آنجا که ترانسپوزونها سیستم های تکثیر ندارند، آنها باید با کروموزوم یا پلاسمیدها ادغام شوند تا ثبات خود را حفظ کنند. ترانسپوزونها می‌توانند در ساختارها و اندازه های مختلف از کمتر از 1 کیلوباز تا 60 کیلوباز متفاوت باشند. کوچکترین نوع آنها توالی ورود (IS) است که معمولا فقط حامل ژنهای ترانسپوزاز است که محصولاتشان واسطه‌ی جابجایی عناصر ژنتیکی هستند. ورود ژنهای اضافی، مانند ژنهای سم، و غالبا ژنهای مقاومت آنتی بیوتیکی، ترانسپوزون‌ها را بزرگتر می‌کند (کیز و همکاران، 2008). ترانسپوزونهای مرکب، مانند Tn9، Tn10، و Tn5706، معمولاحاوی یک یا چند ژن مرکزی مقاومت آنتی بیوتیکی و توالی ورود (IS) در دو انتهای خود هستند. ترانسپوزونهای پیچیده، مانند Tn1721، معمولا توسط توالی های تکراری معکوس انتهایی و نیز گاهی اوقات توالی های تکراری داخلی مشخص می‌شوند که سبب جدا کردن بخش حامل ژنهای مقاومت از قسمت حامل ژنهای ترانسپوزاز می‌شود. همانند پلاسمید‌ها، ترانسپوزونهای کونژوگاتیو و غیرکونژوگاتیو نیز وجود دارند. ترانسپوزونهای کونژوگاتیو به عنوان مثال، Tn916 ، نه تنها در میان گونه‌های باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، بلکه بین هر دو گروه منتقل می‌شود. ژن مقاومت به تتراسیکلین، (tetM)، روی یک ترانسپوزون کونژوگاتیو واقع شده و می تواند در میان چندین جنس از باکتری ها مانند: گونه‌های انتروکوکوس، استافیلوکوکوس، استرپتوکوکوس، اکتینومایسس، بیفیدوباکتریوم، کمپیلوباکتر، قارچ Fusarium nucleatum، گونه های هموفیلوس و نایسریا انتقال یابد (سال‌یرز و شومیکر، 2006)
3-9-2-2- اینتگرون‌ها10-2- ساختار و ویژگی‌های اینتگرون‌هااینتگرون‌ها عناصر ژنتیکی هستند که یک ابزار کارآمد برای گرفتن، بیان و تبادل ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری های گرم منفی را فراهم می‌کنند. اجزای ضروری یک اینتگرون شامل: ژن intI، که یک آنزیم ریکامبیناز با جایگاه خاص شناسایی را رمزگردانی می‌کند و یک سایت نوترکیبی attI، هستند. این سایت نوترکیبی توسط اینتگراز تشخیص داده می‌شود و یک سایت پذیرنده برای کاست‌های ژنی دریافتی است. علاوه بر این، یک پروموتور، Pc، سبب رونویسی از کاست‌های ژنی وارد شده می‌شود (تصویر 3-1). کاست های ژنی شامل یک چارچوب خواندن باز (ORF) برای ژنی که مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می‌کند و همچنین یک سایت نوترکیبی که عنصر 59-بازی (59- be) نامگذاری شده، می‌باشند. این عناصر 59 بازی، توالی‌های تکراری معکوسی هستند که در انتهای ’3 چارچوب خواندن باز، یافت می‌شوند وتوسط اینتگراز تشخیص داده می‌شوند (مک، 2009)

تصویر3-1) ساختمان کلی یک اینتگرون (مک، 2009)
دوگروه عمده از اینتگرونها وجود دارند : انواع کروموزومی Chromosomal integrons (CIs )وانواع متحرک Mobile integrons (MIs ). CIs بر روی کروموزوم صدها گونه از باکتری هاوجود دارند. در طی تحقیقی نشان داده شدکه17 % ژنوم باکتری های تعیین توالی شده آرایش ژنتیکی CIs را نشان داده اند (کمبری وهمکاران، 2010). CIs . اغلب درباکتری های اکوسیستم های دریایی وخاکی مثل گونه های گزانتوموناس و ویبریو شناسایی شده اند. نام دیگر اینتگرونهای کروموزومی super integrons (SIs )می باشد زیرا آنها می توانند تا 200 کاست ژنی راحمل کنند که عملکرد محصول پروتئینی اغلب آنها ناشناخته است (ناس و همکاران، 2001).
کاست های ژنی که تا امروز در MIs شناسایی شده اند معمولا فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می کنند بنابراین به این اینتگرونها resistance integrons (RIs )یاmultidrug resistance integrons (MRIs )گویند (استالدر و همکاران، 2012).
تا کنون کلاسهای متنوعی از اینتگرون‌ها (MIs) شناسایی شده که سه گروه مجزا از آنها در ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی درگیر هستند، که شامل کلاس1، کلاس2، و کلاس3 می‌باشند. کلاس‌های گوناگون اینتگرونها بواسطه‌ی توالی ژن intI، که آنزیم اینتگراز را رمزگردانی می‌کند از هم تمایز داده می‌شوند.1-10-2- کلاس 1 اینتگرون‌ها کلاس 1 اینتگرون‌ها برای اولین بار توسط استوکس و هال در سال 1989 شرح داده شد (استوکس و هال، 1984). آنها هنوز هم شایع‌ترین و گسترده‌ترین طبقه که مورد مطالعه قرار گرفته باقی مانده‌اند. اکثریت شناخته شده‌ی کاست‌های ژنی مربوط به مقاومت به آنتی بیوتیک‌ها، که تا کنون شرح داده شده متعلق به کلاس 1 اینتگرون‌هاست، که خصوصیت ویژه‌ی آنها حضور قسمت ثابت انتهایی 5’ (5’-CS) است. همانطور که قبلا اشاره شد 5’-CS متشکل از سه مولفه اساسی از اینتگرون کلاس1 است که که عبارتند از ژن intI1، یک سایت اتصال attI1 و پروموتور Pc (تصویر4-1)

تصویر4-1: ساختمان کلی کلاس1 اینتگرون‌ها (مک، 2009)
ویژگی دیگر اکثر اینتگرون‌های کلاس1 وجود بخش ثابت انتهای3’ (3’-CS) است. 3’-CS به طور معمول 2384 جفت باز طول دارد و چهار ژن رمز گردان (ORFs) را کد می‌کند (براون و همکاران، 1996). اولین ژن رمزگردان ژن qacE∆1است که نشان دهنده نسخه‌ی کوتاه شده کاست ژنی qacE است که مقاومت در برابر ترکیبات چهارتایی آمونیوم را کد می‌کند (تصویر4-1). این کوتاه شدگی ممکن است به علت قرار گرفتن فاکتور مقاومت سولفونامیدی sul1 در انتهای 3’ آن باشد که منجر به از بین بردن عنصر 59-بازی (59- be) ژن qacE و برخی از توالی‌های رمزگردان آن شده است (پالسن و همکاران، 1993). سومین ژن رمزگردان، ORF5 است که هیچ عملکرد شناخته شده‌ای ندارد اما برخی شباهت‌ها به پورومایسین استیل ترانسفراز نشان می‌دهد (تصویر4-1) (بیسونت و روی، 1992).چهارمین و آخرین ژن رمزگردان، ژن ORF6 است که هیچ عملکرد بیولوژیکی شناخته شده‌ای ندارد (تصویر4-1). انواعی از اینتگرون‌های کلاس1 یافت شده‌اند که فاقد انتهای ثابت 3’ هستند، یکی از این نمونه‌ها اینتگرون کلاس1 است که در ترانسپوزون Tn402 یافت شده است که حاوی کاست کامل ژن qacE است، اما فاقد ژن sul1 و دو ژن رمز گردان دیگر می‌باشد (تصویر5-1) (راداشتروم و همکاران، 1994؛ هولودای و همکاران، 1995). این ترانسپوزون همچنین شامل یک واحد ژن جابجایی (tni module) که حاوی ژن‌های tniA, tniB، tniQ و tniR (که به عنوان tniC شناخته می شود) است، می‌باشد (هولودای و همکاران، 1995)

Related posts: