user852

نمودار4-3) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی نر در روزهای
مختلف بین گروههای کورپیریفاس و DMSO………………………………………………………………………37
نمودار4-4) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی ماده در روزهای
مختلف بین گروههای کورپیریفاس و DMSO………………………………………………………………………37
نمودار 4-5) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی نر در روزهای
مختلف بین گروههای کورپیریفاس و DMSO……………………………………………………………………..38
نمودار4-6) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی ماده در روزهای
مختلف بین گروههای کورپیریفاس و DMSO……………………………………………………………………….38
نمودار 4-7) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی نر در اثر تزریق
غلظتهای مختلف اسکاپولامین در گروههای کورپیریفاس و DMSO………………………………39
نمودار4-8) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی ماده در اثر تزریق
غلظتهای مختلف اسکاپولامین در گروههای کورپیریفاس و DMSO………………………………39
نمودار 4-9) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی نر در اثر تزریق
غلظتهای مختلف MK-801 در گروههای کورپیریفاس و DMSO…………………………………..40
نمودار 4-10) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی ماده در اثر تزریق
غلظتهای مختلف MK-801 در گروههای کورپیریفاس و DMSO………………………………….40
نمودار 4-11) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی نر در اثر تزریق
غلظتهای مختلف اسکاپولامین در گروههای کورپیریفاس و DMSO………………………………41
نمودار 4-12) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی ماده در اثر تزریق
غلظتهای مختلف اسکاپولامین در گروههای کورپیریفاس و DMSO………………………………41
نمودار 4-13) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی نر در اثر تزریق
غلظتهای مختلف MK-801 در گروههای کورپیریفاس و DMSO………………………………….42
نمودار 4-14) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی ماده در اثر تزریق
غلظتهای مختلف MK-801 در گروههای کورپیریفاس و DMSO………………………………….42
نمودار 4-15) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی نر در روزهای مختلف بین گروه کورپیریفاس و DMSO……………………………………………………………………………………………..43
نمودار 4-16) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی ماده در روزهای مختلف بین گروه کورپیریفاس و DMSO……………………………………………………………………………………………..43
نمودار 4-17) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی نر متعاقب تزریق غلظت های مختلف اسکاپولامین بین گروه کورپیریفاس و DMSO…………………………………………………..44
نمودار 4-18) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی ماده متعاقب تزریق غلظتهای مختلف اسکاپولامین بین گروه کورپیریفاس و DMSO……………………………………………………………………………………………………………………………………..44
نمودار 4-19) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی نر متعاقب تزریق غلظت های مختلف MK-801 بین گروه کورپیریفاس و DMSO……………………………………………………….45
نمودار 4-20) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی ماده متعاقب تزریق غلظتهای مختلف MK-801 بین گروه کورپیریفاس و DMSO………………………………………….45
فصل اول
مقدمه
1-1) بیان مساله:
1-1-1 (ترکیبات ارگانوفسفره
ترکیبات ارگانوفسفره بهعنوان حشرهکش در کشاورزی، دامپروری و حتی مصارف خانگی استفاده میشوند. علیرغم محدودیتهای اعمال شده در جهت کاهش تولید و مصرف این ترکیبات، هنوز بیش از نیمی از حشرهکشهای مصرفی حاوی ترکیبات ارگانوفسفره هستند که از جمله مهمترین آلایندههای محیط زیست هستند (Fenske et al., 1990; Eskenazi et al.,1999) استفاده از حشرهکشهای ارگانوفسفره بهدلیل اثرات مخربی که بر رشد مغز دارند در سالهای اخیر محدود شده، با این حال مصرف بعضی از این ارگانوفسفرهها مثل کورپیریفاس به دلیل پایداری بیشتر و سمیت سیستمیک کمتر هنوز ادامه دارد (U. S. EPA 2004). مسمومیت با ترکیبات ارگانوفسفره اثرات متنوعی روی سیستمهای مختلف محیطی و مرکزی دارد.
درکلینیک مسمومیت با ترکیبات ارگانوفسفره غالباً با میزان مهار استیلکولیناستراز سنجش میشود (Ricceri et al., 2003; Jamson et al., 2007). یکی از تاثیرات این مهار، تحریک بیش از حد سیناپسهای کولینرژیک و سیستم عصبی پاراسمپاتیک است که نشانههای آن شامل تنگ شدن مجاری هوایی، تعریق، ترشح بزاق، بی اشتهایی، انقباضات شکمی، استفراغ، بی اختیاری مدفوع و افزایش ادرار میباشد. همچنین ارگانوفسفرهها باعث ایجاد تیکهای ماهیچهای و انقباضات کوچک و غیرارادی عضلات در زیر پوست میشوند. این تاثیرات، ماهیچههای تنفسی را نیز درگیر میکنند. ترکیبات ارگانوفسفره قادرند بر روی سیستم عصبی مرکزی نیز تاثیر بگذارند که نتیجه آن، اضطراب، تخریب حافظه، نقص در سخن گفتن، تشنج و کما میباشد .(Dubois, 1971)ارگانوفسفرههای مختلف تاثیرات سمی متفاوتی بر روی سیستم عصبی دارند، بعضی از ارگانوفسفرهها ازجمله کورپیریفاس تاثیرات سمی بیشتری روی سیستم عصبی دارند،در حالیکه سمیت برخی دیگر مانند پاراتیون بیشتر سیستمیک است(Timofeeva et al., 2008).ترکیبات ارگانوفسفره بهدلیل اثرات مخرب طولانیمدت بر مغز درصورت مجاورت در دوران جنینی و کودکی از نظر پزشکی مورد توجه هستند . (Ricceriet al., 2003)اثرات سمی ارگانوفسفرهها روی مغز در حال تکوین بیشتر است که یکی از دلایل آن مصرف بالای اکسیژن و کمبود آنتیاکسیدان در مغز در حال تکوین میباشد (Slotkin et al., 2008) به عنوان مثال LD50 ترکیب کورپیریفاس در نوزادان موش صحرایی 100 برابر کمتر از بالغین است (Jameson et al.,2007). مطالعات مختلف نشان دادهاند برخی از ارگانوفسفرهها در غلظتهایی که مسمومیت سیستمیک را به دنبال ندارند، بهطورخاص مغز نابالغ را هدف قرار داده و اختلالات رفتاری دراز مدت را باعث میشوند (Ricceri et al., 2003,2006;Eskenazi et al., 1999) کورپیریفاس و نه متابولیت فعال آن (کورپیریفاس اکسان) سنتز DNA را مهار کرده و باعث کاهش تعداد سلولها و اختلال در فعالیت سیناپسی میشود.بنابراین عجیب نیست که کورپیریفاس در غلظتهایی که مهار استیلکولیناستراز پایینتر از حد لازم برای ایجاد مسمویت سیستمیک است، اختلالات رفتاری دراز مدت را باعث میشود (Crumpton et al., 2000; Levin et al., 2007; Jameson et al., 2007; Terry et al., 2007; Johnson et al., 2009).
1-2) صرع
تعریفی که توسط اتحادیه بینالمللی مقابله با صرع (ILAE) و دفتر بین المللی صرع (IBE) برای تشنج ارائه و پذیرفته شده است بدین گونه است که تشنجهای صرعی در اثر شلیک بیش از حد و غیر طبیعی سیگنالهای الکتریکی در مغز ایجاد میشوند و اثرات شدیدی روی سلامت و کیفیت زندگی فرد دارند. تقریباً 5 میلیون نفر در جهان از این بیماری رنج میبرند و صرع دومین اختلال عصبی شایع بعد از سکته مغزی است(Fisher et al., 2005; Zainuddin et al., 2012; Wu et al., 2012)انواع مختلف تشنج ممکن است به دخالت نواحی مختلف مغز مرتبط باشد (Chang and Lowenstein., 2003). تشنجهای صرعی ، انسانها را در تمام سنین تحت تاثیر قرار می دهد و در اثرضایعه مغزی یا ضربه به سر رخ میدهند.(Baxendale et al., 2012) عوامل دیگر ایجادکنندهی این بیماری عبارتند از استعمال بی رویه داروها، عفونت و نواقص ژنتیکی (Rall and sheifer,1991). تغییر در سیستمهای نوروترنسمیتری مختلف بهویژه گلوتامات، آسپارتات و گابا در ایجاد صرع نقش دارند .(Pinto et al ., 2005)بااین حال شواهدی مبنی بر نقض تاثیر انحصاری سیناپسها در بروز صرع وجود دارد: برخی سلولهای ایزوله کشت داده شده بیمهرگان و مهرهداران قادر به تولید فعالیت صرعی هستند .(Speckmann and Caspers, 1973, Segal, 1991) همچنین مهار انتقال سیناپسی با غلظت بالای منیزیم و غلظت پایین کلسیم در مواردی قادر به مهار فعالیت صرعی نیست (Biksonetal., 1999). داروهای سنتزی با اثر بر زیرساختارهای سلولی دخیل در عملکرد سیناپسها و کانالهای یونی از فعالیت صرعی در کانون صرع و گسترش آن به سایر نواحی جلوگیری کرده و باعث مهار تشنج میشوند (Bialer and white, 2010).
1-3) طبقهبندی صرع
طبقهبندی تشنجهای صرعی بر اساس بیان بالینی تشنج و تصویر الکتروانسفالوگرام در طول و بین تشنجها بهدست آمده است. تشنجهای صرعی به 2 دسته جزئی و عمومی تقسیمبندی میشوند . تشنجهای جزئی شامل تخلیههای الکتریکی غیر طبیعی در ناحیهای موضعی از مغز می باشد. این تخلیهها ممکن است موضعی باقی بمانند یا به سایر بخشهای مغز گسترش یابند و باعث ایجاد تشنجهای فراگیر ثانویه شوند. تشنج جزئی به 2 گروه تقسیم میشود: تشنج ساده که هوشیاری تحت تاثیر قرار نمیگیرد. در تشنج پیچیده،حمله در هر دو نیمکره مغز بهطور همزمان شروع میشود و هوشیاری تحت تاثیر قرار میگیرد. تشنجهای عمومی شامل تشنجهای غایب، میوکلونیک و تونیک-کلونیک می باشند (Morimoto et al., 2004).
1-4) کیندلینگ
یکی از مدلهای رایج القاء صرع، کیندلینگ است. کیندلینگ توسط 2 روش ایجاد میشود: 1- کیندلینگ الکتریکی که با تحریکات زیرآستانه مکرر در مناطق خاصی از مغز القاء میشود. 2- کیندلینگ شیمیایی که با تجویز مکرر غلظتهای زیرآستانه ترکیبات صرعزا بروز میکند (Dhir., 2012). کیندلینگ سبب توسعه تشنج، اختلالات رفتاری، آسیب نورونی و سرانجام مرگ نورونی میشود. کیندلینگ با پنتیلن تترازول یکی از رایج ترین شیوهها برای تشدید فعالیت تشنجی است .(Pavlova et al., 2004) تشنجهای صرعی تاثیر قابل توجهی بر ساختار مغز دارند. اولین تغییرات ساختاری مرتبط با تشنجهای مکرر و مرگ انتخابی سلول ها در ساختارهاEpiloptogenic و عمدتاًً در هیپوکامپ است (Naseer et al., 2009). تحقیقات نشان داده اند که بهدنبال تشنج چه به شکل طبیعی و چه با القاء کیندلینگ، مدارهای نورونی دچار اختلال میگردند و معمولا سبب نقص در یادگیری میشوند(Grecksch et al., 1991; Drapeau et al., 2003)
1-5) یادگیری و حافظه
یادگیری فرایندی است که به واسطه آن از دنیای اطراف اطلاعات کسب میشود. حافظه مکانیسمی برای کدبندی، ذخیرهسازی و فراخوانی دوباره اطلاعات ذخیره شده است. دو نوع حافظه داریم:
1- حافظه ناخودآگاه یا مستحکم: شامل یادگیری حرکتی و مهارتهای ادراکی است (پس از تشکیل این نوع حافظه امکان تغییر در آن بسیار اندک است). حافظه ناخودآگاه شامل انواع ارتباطی و غیرارتباطی است. حافظه ناخودآگاه ارتباطی پس از یادگیری خصوصیات یک محرک تشکیل میشود که شامل 2 نوع شرطی شدن کلاسیک و شرطی شدن عامل میباشد. شرطی شدن عامل شامل انواع شرطی شدن احترازی غیرفعال و شرطی شدن احترازی فعال میباشد. نوع غیرارتباطی شامل عادت کردن و حساس شدن میباشد و پس از یادگیری ارتباط بین دو محرک یا یک محرک و یک رفتار تشکیل میشود.
2- حافظه خودآگاه: بهصورت آگاهانه فراخوانی میشود و از تعداد زیادی قطعه حافظهای تشکیل شده که بیشتر در قشرهای ارتباطی مغز ذخیره میگردند. این نوع خود شامل حافظه حادثهای و حافظه معنایی میباشد و دارای انعطاف پذیری بالایی است. حافظه حادثهای مربوط به وقایع و تجربیات گذشته فرد است. حافظه معنایی مربوط به حقایق اشیاء ، نامها و مکانها میباشد(Mclell and et al., 1995 ; Milner et al., 1998). حافظه فضایی جزئی از حافظه خودآگاه است که در کسب و کاربرد اطلاعات مکانی نقش دارد. حافظه کاری (کوتاه مدت) یکی از انواع حافظه فضایی میباشد و در زمانی که حیوان در حال انجام عمل میباشد حفظ میشود و پس از آن به دلیل مورد نیاز نبودن اطلاعات از بین میرود (Optize et al., 1997).
فصل دوم
2- مروری بر تحقیقات پیشین
2-1) ویژگیها و مکانیسم تاثیر ترکیبات ارگانوفسفره
ترکیبات ارگانوفسفره حلالیت بالایی در چربی دارند و بهآسانی از غشاءهای زیستی عبور می کنند (Vale, 1998). جذب پوستی آهسته است، با این حال تماس طولانیمدت میتواند منجر به مسمومیت حاد شود که وجود حلال در فرمولاسیون محصول آن را تشدید میکند(Phillips, 2001) این ترکیبات در بافت چربی، کبد و کلیه انباشته میشوند(Vale, 1998; Kwong, 2002) ویژگی مشترک ترکیبات ارگانوفسفره مهار قوی کربوکسیلاسترهیدرولازها از جمله استیلکولیناستراز (موجود در بافت عصبی و اریتروسیتها) و بوتیریلکولیناستراز (پزودوکولین استراز) است. استیلکولیناستراز موجب تجزیه استیلکولین در سیناپسهای کولینرژیک بوده و مهار غالباً برگشت ناپذیر آن توسط ارگانوفسفرهها موجب تجمع استیل کولین و فعالیت شدید و کنترل نشده سیناپسهای کولینرژیک میشود. تحریک مداوم رسپتورهای موسکارینی و نیکوتینی استیلکولین موجب ایجاد علایم ناشی از مسمومیت حاد با ارگانوفسفرهها میشود (Ward and Mundy, 1995; Rocha et al., 1996; O malley 1997; Fryer et al., 2004) همه ارگانوفسفرهها در غلظتهای بالا سبب مهار استیلکولیناستراز می شوند (Bushnel et al., 1993; Samsam et al., 2005)، اما غلظتهای پایین ترکیبات ارگانوفسفره که قادر به مهار استیلکولیناستراز نیستند، مکانیسمهای دیگری برای ایجاد سمیت در سیستم عصبی دارند که این مکانیسمها از ترکیبی تا ترکیب دیگر متفاوت است (Aldridge et al., 2005). شدت سمیت ارگانوفسفرهها بستگی به این دارد که تا چه اندازه قادرند مکانیسمهای غیروابسته به استیلکولین را فعال کنند (Timofeeva et al., 2008). از تاثیرات غیر کولینرژیک ارگانوفسفرهها میتوان به تاثیر روی فاکتورهای رونویسی و تمایز سلول، آسیب به DNA و مکانیسمهای درگیر در آکسوژنز، سیناپتوژنز و عملکرد سیناپسی که باعث اختلال در تکوین سیستم عصبی میشوند اشاره کرد .(Crumpton et al., 2000)
2-2) اثرات بیولوژیک کورپیریفاس
مطالعه مدلهای حیوانی و شواهد کلینیکی نشان داده است که کورپیریفاس از طریق مهار کولیناستراز و مکانیسمهای غیرکولینرژیک مغز در حال رشد را تحت تاثیر قرار داده و منجر به نقایص نورونی و رفتاری میشود .(Pope et al., 1999; Barone et al., 2000) کورپیریفاس سبب مداخله در رونویسی و تمایز سلولهای نورونی و اختلال در تکوین سیناپسها و عملکرد آنها میشود(Dam et al., 1999; Crumpton et al., 2000; Slotkin, 2004; Casida and Quistad, 2004) کورپیریفاس بر پروتئینهای ساختار نورونی (Garcia et al., 2003) ، تعدیل طولانیمدت فعالیت سیناپسی در سیستم عصبی مرکزی و محیطی (Aldridge et al., 2004; Meyeretol., 2004)، ویژگیهای ساختاری از جمله ضخامت کورتکس(Byers et al ., 2005) ، عملکردهای شناختی (Levin et al., 2002; Aldridge et al., 2005 a) و فعالیتهای حرکتی (Dam et al., 2000) تاثیر میگذارد.
2-3) تاثیر وابسته به زمان و وابسته به جنس ترکیبات ارگانوفسفره
اگر تیمار با ارگانوفسفره همزمان با تکوین ناحیه خاصی از مغز باشد، آن ناحیه تحت تاثیر قرار میگیرد در حالیکه اگر قبل و یا بعد از تیمار تکوین پیدا کنند، دستخوش تغییر نمیشوند و یا تغییرات کمی را نشان میدهند. تزریق غلظت 1 میلیگرم بر کیلوگرم کورپیریفاس به نوزادان موش صحرایی در روزهای 4-1پس از تولد و ارزیابی فعالیت استیلکولینترانسفراز در نواحی هیپوکامپ، مغز میانی، استریاتوم، ساقهی مغز و کورتکس در دوران بلوغ، نشان داده است که کورپیریفاس در همهی نواحی مغزی به طور مشخصی باعث کاهش فعالیت استیلکولینترانسفراز میشود. این تاثیر البته وابسته به زمان تزریق، جنس و ناحیه مغزی است(Slotkin et al., 2001) بسته به اینکه قرار گرفتن در معرض ارگانوفسفرهها در چه دوره ای از تکوین مغز باشد ممکن است اثرات آن در دو جنس نر و ماده متفاوت باشد به طوریکه اگر تیمار با ارگانوفسفرهها قبل از دوران تمایز جنسی در مغز باشد، تفاوتهای وابسته به جنس در تاثیرات نهایی آنها ایجاد نمی شود در حالیکه اگر تیمار در دوران وقوع تمایز جنسی در مغز باشد، تاثیرات متفاوتی در اثر تیمار با یک ترکیب ارگانوفسفره در دو جنس ظاهر میشود، در بعضی موارد نیز این تاثیرات در دو جنس یکسان بوده ولی در یک جنس بارزتر است (Aldridge et al., 2005) تاثیر وابسته به جنس کورپیریفاس در استریاتوم نیز دیده شده است بهطوریکه کاهش مارکرهای کولینرژیک در مادههایی که در روزهای 4- 1پس از تولد تیمار شده اند، شدیدتر بوده است. بیشترین اثر کاهشی مارکرهای کولینرژیک در اثر مجاورت با کورپیریفاس در هیپوکامپ و کمترین اثر در قشر مغز است (Slotkin et al., 2001; Levin et al., 2001).2-4) تاثیر ارگانوفسفرهها به ویژه کورپیریفاس در ایجاد افسردگی و نقص حافظه ناشی از تغییر در سیستمهای نوروترنسمیتری
دوره پس از تولد در جوندگان بهخاطر تکوین مسیرهای کولینرژیک در Basal forebrain بسیار حیاتی و مهم است. این مسیرها در میزان تحریک مغز بسیار مهماند و مجاورت با کورپیریفاس این تنظیم را مختل کرده (Berger – Sweeney and Hohmann, 1997) و از طریق مداخله در بلوغ مغز سبب اختلالات رفتاری میشود (Levin et al., 2001; Aldridge et al., 2005a) کورپیریفاس از طریق تغییر طولانیمدت در فعالیت سیستم سروتونرژیک و غیر نرمال شدن رشد مسیرهای سروتونرژیک منجر به بروز پرخاشگری در موشهای صحرایی می شود (Bell and hobson, 1994; Aldridge et al., 2004) تزریق کورپیریفاس (1 میلیگرم بر کیلوگرم) در روزهای 4-1 پس از تولد منجر به اختلال در رشد و تمایز نورونی، تغییر در بیان ژنهای وابسته به سروتونین و افزایش بیان رسپتورهای سروتونینی میشود. این تغییرات، تخریب پایانههای نورونهای سروتونرژیک در حال رشد را به دنبال دارد که تغییرات آنی و طولانیمدت از قبیل نقص در رفتارهای وابسته به سروتونین مثل عواطف و احساسات را باعث میشود .(Heninger,1997; Roeggea et al., 2008) نشان داده شده است که موشهایی که در دوران پیش از تولد غلظتهای پایین کورپیریفاس را دریافت کردند الگوهای رفتاری مثل افسردگی را نشان میدهند که تغییر در سیستمهای سروتونرژیک و دوپامینرژیک را در این پدیده دخیل دانستند. همچنین ارتباط روشنی بین انسانهایی که در معرض ارگانوفسفرهها قرار گرفتند با افسردگی و خودکشی دیده شده است(Aldridge et al., 2005b; London et al., 2005; Lee et al., 2007) این ترکیب در غلظتهای پایین باعث اختلال در رفتار و عملکردهای شناختی (Colborn, 2006)، بیش فعالی حرکتی (Icenogle et al., 2004) و اختلال در حافظه کاری و حافظه مرجع میشود . (Levin et al., 2001; Aldridge et al., 2005a)مسمومیتهای حاد و مزمن با ترکیبات ارگانوفسفره منجر به تغییرات طولانی مدت در عملکردهای نوروفیزیولوژیک، فرآیندهای شناختی مثل سرعت پردازش اطلاعات، توجه بینایی، توانایی در ادارک بینایی و اختلال در حافظه حل مساله میشود(Steenland et al., 1994; Farahat et al., 2003; Roldan- topia et al., 2005, 2006). انسانهایی که در صنعت و کشاورزی به مدت طولانی در معرض سطوح کم ارگانوفسفره قرار میگیرند حتی بدون بروز علائم سمیت کولینرژیک، دچار اختلالات طولانی مدت در حافظه، تمرکز، توجه و سرعت آنالیز اطلاعات میشوند(Gershon and Show, 1961; Metcalf and holmes, 1969; Rauhe et al., 2006). رابطه بین اثر بر حافظه و غلظت کورپیریفاس خطی نبوده و بیشترین تاثیر در غلظتهای پایین بروز کرده با افزایش غلظت به میزان بالاتر از آستانه تشخیص مهار استیلکولیناستراز ، این تاثیر حذف یا معکوس میگردد (Levin et al., 2002).2-5) مکانیسم ایجاد صرع
فعالیت تشنجی صرع در اثر عدم تعادل بین فعالیتهای تحریکی و مهاری سیناپسی است (Madsen et al., 2010). صرع معمولا در نتیجه کاهش عوامل مهاری یا افزایش شدید تحریکپذیری بخشی از شبکه نورونی مغز رخ میدهد(Stafstrom, 2003, Pinto et al., 2005, Beck and Elger, 2008) صرع غالبا به دنبال افزایش تحریک گلوتاماترژیک یا کاهش مهار گاباارژیک ایجاد میشود (Obrenoritch et al., 1996). کاهش مهار گاباارژیک در نتیجه کاهش رهاسازی گابا از پایانههای عصبی، کاهش حساسیت رسپتورهای گابا و تغییر در شیب غلظت یونی بهعلت تجمع داخل سلولی یون کلر میباشد (Deyn et al., 1990). گابامهمترین نوروترانسمیتر مهاری در سیستم عصبی مرکزی است (Fritschy and Brunig , 2003). گابا در تکوین اولیه مغز شرکت میکند و تعیین کننده مهم عملکرد عصبی- رفتاری است. گابا از گلوتامات توسطL– گلوتامیکاسیددکربوکسیلاز سنتز میشود (Badaway et al., 2009). سطح گابا و فعالیتL– گلوتامیکاسیددکربوکسیلاز در بافتی که کانون صرع است و همچنین در مایع مغزی نخاعی بیماران صرعی کاهش یافته است (De Deyn et al., 1990). رسپتورهای گابا عبارتند از رسپتورهای یونوتروپیک گابا A و گابا C و رسپتورهای متابوتروپیک گابا B. رسپتورهای گابای A کانال دریچهدار لیگاندی هستند و هنگام باز شدن باعث ورود کلر به سلول و ایجاد پتانسیل سیناپسی مهاری میشوند (Cavazos and Lum, 2005). رسپتور گابا A بهصورت پسسیناپسی روی دندریتهای غشای سوماتیک و بخش اولیه آکسون قرار دارد (Delorenzo et al., 2005). رسپتورهای گابا C کانال یونی دریچهدار لیگاندی هستند. فعال شدن کانال این رسپتورها نفوذپذیری به یون کلر را افزایش میدهد. تعدادی از آگونیستهای رسپتور گابا A مثل باکلوفن نمیتوانند با رسپتور گابا C برهم کنش داشته باشند. این رسپتورها در شبکیه، نخاع، غده هیپوفیز و برجستگی فوقانی یافت میشوند .(Goodman et al., 2006) رسپتور گابا B از دو زیر واحد گابا B1 و گابا B2 تشکیل شده است (Gassman et al., 2004). رسپتورهای گابا B لینک شده بهG–پروتئینها هستند که با افزایش کنداکتانس پتاسیم و مهار ورود کلسیم نورونها را هایپرپلاریزه میکنند و اثر مهاری آهستهای دارند (Delorenzo et al., 2005). گلوتامات مهمترین نوروترانسمیتر تحریکی در سیستم عصبی مرکزی است (Cavazos and Lum, 2005). گلوتامات در ترمینالهای پیشسیناپسی از گلوتامین توسط گلوتامیناز فعال شده با فسفات، همچنین از 2- اگزوگلوتارات توسط گلوتاماتدهیدروژنازو 2- اگزوگلوتاراتآمینوترانسفراز سنتز میشود (Meldrum et al., 1999) رسپتورهای یونوتروپیک گلوتامات، کانالهای دریچهدار لیگاندی هستند و شامل انواع NMDA،AMPA و Kainate میباشند .رسپتورهای AMPAشامل 7 زیر واحد میباشند و به کاتیونهای تک ظرفیتی سدیم و پتاسیم نفوذپذیرند و سبب ایجاد پتانسیلهای پس سیناپسی تحریکی سریع میشوند (Morimoto et al., 2004). رسپتورهای Kainate به کاتیونهای تک ظرفیتی نفوذپذیرند. رسپتورهای NMDA پتانسیلهای پسسیناپسی تحریکی آهسته و جریان یون کلسیم را میانجی میکنند و به سدیم و پتاسیم نیز نفوذپذیرند. این رسپتور از 7زیر واحد تشکیل شده است (Morimoto et al., 2004 ., Kohr., 2006., Mallon et al., 2004) رسپتورهای متابوتروپیک با پیکهای داخل سلولی ارتباط دارند و دارای N-ترمینال بسیار بزرگ برای اتصال گلوتامات هستند (Kew and Kemp.,2005). کاهش دوپامین در هسته دم دار و افزایش نورآدرنالین در مغز میانی موشهای صحرائی دارای فعالیت صرعی دیده شده است (Hara et al., 1993). شواهدی مبنی بر تداخل عوامل ژنتیکی و محیطی در ایجاد صرع وجود دارد .(Berkovic et al., 2006) بسیاری از اختلالات ژنتیکی در ژنهای کد کننده کانالهای یونی، منجر به عدم تعادل بین انتقال عصبی مهاری و تحریکی ودر نهایت صرع میگردد. بیشتر سندرمهای صرعی مربوط به اختلال عملکرد کانالها هستند(Armijo et al., 2005, Shin and Mc Namara,1994).
2-6 (مدل کیندلینگ در مطالعه صرع
کیندلینگ مدلی از تشنجهای پیچیده است. کیندلینگ تحریکپذیری عصبی را افزایش داده، منجر به توسعه تشنج، آسیب نورونی و اختلالات رفتاری میشود و همچنین تا حدی شبیه به اختلالات دیده شده در صرع لوب گیجگاهی در انسان است. کیندلینگ همچنین یک مدل مناسب آزمایشگاهی برای مطالعه مکانیسمهای تغییرات مرتبط با صرع در نظر گرفته می شود McEachern and Shaw, 1999)). در این مدل تحریکات زیر آستانه ای پشت سر هم توسط جریان الکتریکی یا مواد شیمیایی ایجاد میشود که منجر به بروز تشنجات میگردد.(Luthman and Humpel., 1997) کیندلینگ نخستین بار توسط Goddard بهعنوان مدل آزمایشگاهی صرع که با پلاستیسیتی نورونی و افزایش فعالیت تشنجی ارتباط دارد معرفی شد (Da-Silva et al., 1998)، او در این نوع کیندلینگ (کیندلینگ الکتریکی )با قرار دادن الکترود در ساختار لیمبیک، تحریکات الکتریکی ایجاد میکرد. کیندلینگ شیمیایی توسط ترکیبات شیمیایی صرع زا پیلوکارپین، کاینیک اسید ، پیکروتوکسین و پنتیلنتترازول ایجاد میشود (KOhling, 2002). کیندلینگ ناشی از پنتیلین تترازول اولین بار توسط Mason و Cooper در سال 1972 شرح داده شد که با افزایش تشنجها بعد از تزیقات مکرر پنتیلینتترازول مشخص میشود .(Mason and cooper, 1972) پنتیلنتترازول آنتاگونیست غیر رقابتی گابا است و روی جایگاه پیکروتوکسین گیرنده گابا Aاثرکرده و مانع ورود کلر میشود. اثرات پنتیلنتترازول روی گیرنده گابا A وابسته به غلظت و غیر وابسته به ولتاژ است (Hung et al ., 2001) پنتیلینتترازول همچنین میتواند با تحریک گیرنده NMDA موجب تحریک سیستم عصبی مرکزی و ایجاد تشنج شود (Nevins and Arnolde 1989; Sayyah et al., 2002). افزایش فعالیت انتقال گلوتاماترژیک منجر به تولید رادیکال آزاد میشود که نقش مهمی در مرگ نورونها در نواحیCA1وCA2 هیپوکامپ موشهای کیندل شده با پنتیلینتترازول دارد و سبب اختلالات یادگیری میشود.(Gupta et al., 2003; Singh et al., 2003) تشنجهای صرعی با افزایش نفوذپذیری به مواد موجود در خون و باز شدن اتصالات محکم بین سلولهای اندوتلیال و عروق مغزی منجر به اختلال در سد خونی- مغزی میشوند، در نتیجه ماکرومولکولهایی مثل پروتئینها میتوانند از سد خونی-مغزی عبور کنند ((Arican et al., 2006.
2-7) ساختارهای مغزی و سیستمهای نوروترنسمیتری دخیل در حافظه
اثرگذارترین سیستم نوروترنسمیتری در یادگیری فضایی ، سیستم کولینرژیک است. بعداز آن گلوتامات، دوپامین، سروتونین، نوراپینفرین و گابا به ترتیب از اهمیت بیشتری برخوردارند (Wilson et al., 1995). مطالعات انجام شده روی انسان و حیوان نشان داده است که سیستم کولینرژیک و بهخصوص گیرندههای موسکارینی استیلکولین، در حافظه نقش دارند (Bymaster et al., 1993). مطالعات تصویری از فعالیت مغز ، افزایش فعالیت کولینرژیک و کاهش فعالیت آنتیکولینرژیک را در مناطق زیر قشری مغز مانند تالاموس نشان میدهد که مناطق هوشیاری و توجه می باشند .(Freo et al., 2002) هسته قاعدهای با سلولهای درشت(NBM) یکی از هستههای مغز جلویی است که 90 درصد نورونهای این هسته کولینرژیک است.80-70 درصد اعصاب کولینژیک قشر مغز از NBM منشاء گرفتهاند (Houser et al., 1985; Eckenstein et al., 1988;Miranda et al., 2003)اکثر استیلکولینی که در قشر مغز یافت میشود، منشا خارج قشری دارد و قسمت عمده ای از آن توسط نورونهای کولینرژیک NBM به قشر آزاد میشود (Kensner et al., 1987). مسیرهای کولینرژیک NBM به آمیگدال و قشر و همچنین NBM به سپتوم و هیپوکامپ در ایجاد حافظه نقش مهمی را ایفاء میکند .(Brozhink and Vinog–ova.,1988ارتباط عمده هیپوکامپ با قشر انتورینال است که هیپوکامپ را به سایر نواحی قشری متصل میکند .(Carew, 2000) همچنین هیپوکامپ با آمیگدال، هیپوتالاموس، عقدههای قاعدهای، سپتوم، اجسام پستانی و تالاموس ارتباط دارد .(Carew,2000;Bloom,2001) در تقسیمبندی جزئی هیپوکامپ به 4 ناحیه CA1، CA2، CA3 و CA4 تقسیم میشود و CA1 و CA3 بزرگترین بخشهای آن هستند .(Carew,2000) مشخص شده که ناحیه CA3 هیپوکامپ نقش مهمی در یادگیری و حافظه فضایی دارد، به طوریکه مهار آورانهای تحریکی به CA3 سبب اختلال در این پدیده میگردد(Meilandt et al., 2004) . سیستم کولینرژیک در ناحیه CA1 هیپوکامپ و تاثیر آن بر روند حافظه و یادگیری از اهمیت ویژه برخوردار است (Paul et al., 1995). در هیپوکامپ3 مسیر نورونی عمده وجود دارد :مسیر پرفورانت :فیبرهای ورودی از قشر انتوریال با سلولهای دانهدار در شکنج دندانه ای سیناپس برقرا میکند.
مسیر فیبر خزه ای :آکسون سلولهای دانه دار با سلولهای هرمی در ناحیه CA3 سیناپس برقرار میکند.
مسیر دستجات شافر :در این مسیر آکسون سلولهای هرمی در ناحیه CA3 با سلول های هرمی CA1 سیناپس برقرار میکنند . از ناحیه CA1 با قشر انتورینال ارتباط وجود دارد.
در حقیقت در هیپوکامپ مداری متشکل از 3 سیناپس وجود دارد که شامل سیناپس بین آورانهای قشر انتورینال باسلولهای شکنج دندانهای، سیناپس بین آکسون سلولهای شکنج دندانهای با سلولهای هرمی ناحیه CA3 و سیناپس بین نورونهای هرمی CA3 با سلولهای هرمی CA1 میباشد، این 3 مدار بهطور وسیعی از طریق ثبت داخل سلولی و خارج سلولی مطالعه میشوند (Carew, 2000; Shephered, 1994). استیل کولین دارای دو گروه گیرندههای موسکارینی و نیکوتینی است. گیرندههای موسکارینی دارای 5 زیر گروه میباشند (M1-M5). بین سیستم کولینرژیک و سایر سیستمهای نوروترنسمیتری در فرآیندهای حافظه واکنش متقابل وجود دارد (Dunnett et al., 1985; Bymaster et al., 1993) مطالعات پیشنهاد میکند که نقش استیلکولین مخصوص اعمال حافظه نیست اما بهطورکلی در توجه و بعضی فرمهای پلاستیسیتی سیناپسی نقش دارد. اسکاپولامین، آنتاگونیست رسپتور M1 موسکارینی است که با مسدود کردن این رسپتور باعث نقص حافظه میشود. تمایل اسکاپولامین به باند شدن به رسپتورش در مغز رتها در حدود nM1 است. دوزهای بالای اسکاپولامین همچنین رسپتورهای نیکوتینی را بلوک میکند. اسکاپولامین به عنوان یک داروی آلکالوئیدی مرجع برای ایجاد فراموشی در انسان و حیوان استفاده میشود. وقتی اسکاپولامین با دوزهای بالاتر ازmg/kg 1/0استفاده میشود، باعث اختلال در حافظه و یادگیری میشود. اسکاپولامین علاوه بر تاثیر بر حافظه و یادگیری روی انواع مختلف رفتار، فعالیت حرکتی، اضطراب و توجه اثر میگذارد. اسکاپولامین در درجه اول روی پروسههای حسی و توجه اثر میگذارد. از آنجا که فراموشی ناشی از اسکاپولامین به دلیل مهار سیناپسهای کولینرژیک است، از این ماده به عنوان یک مدل آسیبهای شناختی که در پیری و زوال عقل مشاهده میشود استفاده میگردد. اسکاپولامین پروسههای درگیر در دریافت و تثبیت حافظه را تخریب میکند. (Vader s– et al., 2005) آگونیستهای گیرنده گابا از طریق آزادسازی استیلکولین به حافظه آسیب میرسانند، در حالیکه آنتاگونیستهای گابا، حافظه را تسهیل میکنند (Brioni et al., 1989) کنش متقابل سیستمهای کولینرژیک و سروتونرژیک نقش مهمی در یادگیری و حافظه دارد. سروتونین در اعمال فیزیولوژیک مختلف از جمله حافظه نقش دارد. گیرندههای سروتونین به 4 دسته5-HT1 ، 5-HT2،5-HT3 و 5-HT4تقسیم بندی میشوند. تحریک گیرندههای 5-HT در ناحیه CA1 در هیپوکامپ پشتی موشها به تشخیص فضایی آنها آسیب میرساند (Mann and Yates, 1983; Wilkinson and Dourish,1997) تحریک گیرندههای 5-HT1Aبه حافظه آسیب وارد میکند (Stancompiano, 1999). عملکرد سروتونین در حافظه بستگی به این دارد که سروتونین برکدام رسپتور تاثیر داشته باشد (Skirzewski et al., 2010). دوپامین بهعنوان سوبسترای بالقوه در شکلپذیری سیناپس و مکانیسمهای حافظه معرفی شده است (Jay,2003). برای اولین بار Brozoski به اهمیت دوپامین و نوراپی نفرین در حافظه کاری پی برد. تزریق 6- هیدروکسی دوپامین به سپتوم باعث کاهش دوپامین و در نتیجه آسیب به حافظه موشهای صحرائی در ماز شعاعی میشود (Simon et al., 1986). فعالیت دوپامینرژیک مرتبط با انگیزش است. محروم کردن موشهای صحرایی به مدت 20 ساعت از غذا، منجر به افزایش دوپامین در هسته Accumbans میشود. رسپتورهای دوپامینی D1 نقش حیاتی در تاثیر دوپامین بر عملکرد پره فرونتال و حافظه کاری دارد (Lidow et al., 1991; Wilson et al., 1995) تحریک گیرندههای پیش سیناپسی دوپامین D2 باعث بهبود بازیابی حافظه میشود، درحالیکه غلظتهای بالای آن با تحریک گیرندههای پسسیناپسی دوپامینی D2 به بازیابی حافظه آسیب میزند (Kebabian et al., 1979). مهار رسپتور NMDA گلوتامات با آنتاگونیست غیر رقابتی MK- 801 و آنتاگونسیت رقابتی AP5 مانع از تشکیل LTP (تقویت طولانی مدت) در ناحیه CA1 و شکنج دندانه ای هیپوکامپ میشود (Errington, 1987). MK-801 یا دیزوسیلپین آنتاگونیست غیر رقابتی رسپتور NMDA میباشد. زمانی که کانالهای رسپتور NMDA باز هستند، اجازه میدهند یون های کلسیم وارد سلول شوند و در نتیجه نیتریک اکساید ساخته میشود. بنابراین، این رسپتورها در انتقال سیناپسی و پتانسیل طولانی مدت نقش دارند. این رسپتورها در حافظه و یادگیری نقش دارند و در هیپوکامپ پشتی هستند. MK-801 از ورود سدیم و کلسیم به داخل سلول و همین طور از خروج پتاسیم جلوگیری مینماید .MK-801 باعث اختلال یادگیری مهارت های بینایی-فضایی میشود. این مهارت ها برای پاسخ های فضایی به اشیا رنگی و مهارتهای تشخیص بینایی مشکل نیاز هستند.MK-801 موجب تخریب حسی- حرکتی در موش ها میشود. این دارو سبب آسیب پایانه های آکسون، میکروگلیا، کورتکس رترواسپلنیال، پیریفرم کورتکس، کورتکس انتورینال، آمیگدال، تنیا تکتی و جیروس دندانه ای تمپورال میشود. تزریق دوطرفی MK-801 به تالاموس جلویی مغز موش سبب تشکیل پروتئین شوک حرارتی (HSP 70) در نورونهای پیرامیدال در لایه 3 کورتکس رترواسپلنیال و آسیب نورونها میگردد. MK-801 بهصورت حاد و مزمن اثرات مختلفی روی رسپتور دوپامین D1 و D2 دارد و سبب کاهش گلوتامات و دوپامین در کورتکس پرهفرونتال میگردد. دوزهای پایین MK-801 سبب تحریک حرکتی در موش میشود در حالیکه دوزهای بالاتر آن باعث آتاکسی، رفتارهای کلیشه ای و کاتاپسی (جمود عضلات ) میشود (lapin and Roqaski, 1995). نیتریک اکسید(NO) نیز در حافظه نقش دارد. نیتریک اکسید در فرآیند یادگیری فضایی نقش دارد .(Rezayof et al., 2006) در آزمایشی که Bohme با استفاده از ماز شعاعی هشت بازویی انجام داد، مشاهده کرد که استفاده سیستمیک از مهارگر NOS قادر به بلوک کردن LTP هیپوکامپ است و باعث کاهش یادگیری فضایی میشود .مسیر های نورآدرنرژیک نقش مهمی در تنظیم حافظه و یادگیری دارند (Sirvio et al., 1999). تزریق سیستمیک پروپرانولول با غلظت 10 mg/kg از طریق آنتاگونیستی بر گیرنده بتانورآدرنرژیک سبب آسیب حافظه در ماز شعاعی میشود (Przybyslawski, 1999). هیستامین حافظه را کاهش میدهد (Eidi et al., 2003) ممکن است در فرآیند تثبیت حافظه، سیستم هیستامینرژیکبا سیستم کولینرژیک ارتباط متقابل داشته باشد، زیرا دیده شده که تحریک گیرندههای موسکارینی، رهاسازی هیستامین در مغز موش را کاهش میدهد (Gulat – Murray et al., 1989).2-8(تاثیر صرع بر یادگیری و حافظه
بیماران صرعی اغلب نواقصی را در حافظه و یادگیری از خود نشان میدهند (Cavazos and sutula, 1990) تاثیر برخی ترکیبات درکاهش اختلال یادگیری ناشی از کیندلینگ به اثر آنتیاکسیدانی و حذف رادیکالهای آزادنسبت داده شده است(Rauca et al., 1999;Singh et al., 2003) در حیوان بالغ صرعهای شدید باعث آسیبهای نورونی در ناحیه CA1 و CA3 و جیروس دندانی هیپوکامپ میشوند که سبب جوانه زدن آکسون سلولهای گرانولی در نواحی Supra granular، Fascia dentate، Stratum infropiramidal از ناحیه CA3 شده و در نهایت منجر به نقص طولانیمدت در یادگیری، حافظه و رفتار میشود (Liu et a., 1999). در نتیجه فعالیت با الگوی صرعی و کیندلینگ LTP و LTD تشدید میشود (Leung and Wu, 2003; Abegg et al., 2004). تغییر در تعادل LTP ممکن است بر شکلگیری حافظه تاثیر داشته باشد، بنابراین حیوانات کیندل شده در عملکردهایی که به حافظه فضایی احتیاج دارند، توان کمتری در مقایسه با نمونههای کنترل دارند .(Grecksch, 1991; Robinson et al., 1993) در انسان مبتلا به صرع و در مدلهای صرعی حیوانی، کاهش خارهای دندریتی در نورونهای پیرامیدال هیپوکامپ و سلولهای گرانوله جیروس دندانهای دیده شده که این کاهش خارهای دندریتی میتواند یک مکانیسم منطقی برای توضیح آسیب یادگیری و حافظه در بیماران مبتلا به صرع باشد. احتمالا مکانیسمهای اکسیتوکسیک فعال شده به وسیله گلوتامات در تغییرات خارهای دندریتی القا شده به وسیله حملههای صرعی درگیر است (Wong, 2005) همچنین با توجه به نقش اساسی و شناخته شده استیلکولین در انواع حافظه و یادگیری، تغییر در رهایش استیلکولین هیپوکامپ در طی روند کیندلینگ میتواند در نقص حافظه و یادگیری در حیوانات کیندل شده با پنتیلن تترازول دخیل باشد (Ben-Ari et al., 1981).
2-9( هدف
در این مطالعه اثر دریافت غلظت پایین کورپیریفاس در دوره نوزادی بر نقص شناختی ناشی از کیندلینگ شیمیایی با استفاده از آزمون ماز شعایی میباشد. همچنین تاثیر پیشتیمار اسکاپولامین و MK-801 برای تعیین میزان وابستگی عملکرد شناختی به سیستمهای کولینرژیک و گلوتاماترژیک مورد بررسی قرار میگیرد.
فصل سوم
3- مواد و روشها
3-1) مواد مورد استفاده:
کورپیریفاس
DMSO
پنتیلن تترازول
سالین
اسکاپولامین
MK-801
پروپرانولول
الکل
اتر
بادام زمینی
غذای مخصوص موش
3-2) وسایل و دستگاهها:
ماز شعاعی هشت بازو(Radial arm maze)
ترازو
سمپلر 10-1 میکرولیتری
سمپلر 100-10 میکرولیتری
سمپلر1000-100میکرولیتری
سرنگ همیلتون
سرنگ انسولین
دستکش لاتکس
قفس و ظرف آبخوری موش
3-3) حیوانات و تیمار
تعداد کل نمونهها در شروع کیندلینگ 58 سر بود. تعداد نمونهها در مطالعه رفتاری 38 سر بود که گروه کورپیریفاس شامل 12 سر نر و 10 سر ماده و گروهDMSOشامل 10 سر نر و 6 سر ماده بود. موشهای صحرایی سفید آزمایشگاهی(Rat) از نژاد ویستار با وزن 180 تا 220 گرم از مؤسسه سرم سازی رازی تهیه شده و در اتاق حیوانات بخش زیستشناسی با دمای 2±22 درجه سانتیگراد و سیکل 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. آب و غذا به میزان کافی در اختیار موشها قرار داشت. برای جفت گیری، دو موش صحرایی ماده و یک موش صحرایی نر در یک قفس قرار میگرفتند. به منظور اطمینان از باردار بودن ماده ها، هر روز از آن ها تست اسمیر گرفته میشد. پس از بررسی میکروسکوپی نمونه اسمیر و دیدن اسپرم، موش ماده مورد نظر از سایرین جدا شده و در یک قفس مجزا نگهداری میشد و آن روز به عنوان روز صفر حاملگی در نظر گرفته میشد. پس از تولد نوزادان که تقریبا بیست و یک روز بعد بود، تاریخ زایمان و تعداد نوزادان ثبت میگردید واز بین نوزادان هر مادر که بین 6 تا 17 عدد بودند، در صورتیکه تعداد نوزادان کمتر از 8 بود تمام آنها و در غیر این صورت 8 نوزاد انتخاب شده و در کنار مادر نگه داری میشدند. به نوزادان موش صحرایی در روزهای 4-1 پس از تولد ترکیب ارگانوفسفره کورپیریفاس به صورت محلول در DMSO و به میزانی که از آستانه مهار کولین استراز فراتر نرود با استفاده از سرنگ همیلتون به صورت زیرپوستی تزریق میشد. میزان تزریق روزانه کورپیریفاسml/kg1بود. به نوزادان گروه کنترل حجم معادلی از DMSO تزریق میشد.
3-4) کیندلینگ
از روز 60 پس از تولد به مدت 28 روز هر 48 ساعت به گروه مورد آزمایش و گروه کنترل PTZ با غلظتmg/kg 5/37 به صورت داخل صفاقی تزریق میشد (کیندلینگ). پس از هر تزریق پنتیلنتترازول حیوان دریک جعبه قرارداده میشد و فعالیت تشنجی درموش به مدت 20 دقیقه مشاهده میگردید. تغییرات رفتاری درموش برطبق ضوابطBacker درجهبندی میشد: مرحله صفر: بدون پاسخ، مرحله 1: انقباضات عضلات صورت وگوشها ، مرحله 2: پرشهای میوکلونیک بدون بلندشدن روی دوپا، مرحله 3: پرشهای میوکلونیک وایستادن روی دوپا، مرحله 4: حملات تونیک-کلونیک وافتادن به پهلو، مرحله 5: افتادن به پشت و حملات تونیک کلونیک عمومی. برای ارزیابی آستانه تشنج درهرگروه،7روز بعد ازآخرین تزریق پنتیلنتترازول موشها یک غلظت چالش از پنتیلنتترازول (37میلی گرم درکیلوگرم) دریافت میکردند، سپس رفتارتشنجی با همان مقیاس قبل درجهبندی میشد. به موشی که 3 جلسه پشت سر هم تشنج درجه 4 یا 5 را نشان دهد، اصطلاحا موش کیندل شده گفته میشود. موش های کیندل شده یک هفته بعد از پایان دوره کیندلینگ مورد آزمون ماز شعاعی قرار میگرفتند.
3-5) آزمون یادگیری حافظه فضایی با ماز شعاعی هشت بازویی
برای ایجاد انگیزه حرکت در ماز، در طول دوره آزمون ماز شعاعی غذای هر موش به حدود 85 درصد مقدار طبیعی کاهش یافت و وزن هر موش در این دوره به 90-85 درصد وزن اولیه میرسید. برای سنجش حافظه فضایی (حافظه کاری و حافظه مرجع) از ماز شعاعی هشت بازویی استفاده شد. این ماز دارای یک میدان مرکزی و 8 بازو بود که به صورت شعاعی از آن خارج میشدند. قطر محفظه مرکزی 32 سانتی متر بود. طول و عرض هر بازو به ترتیب 66 و 10 سانتیمتر بوده و در انتهای هر بازو ظرف مخصوص بادام زمینی وجود داشت.
3-5-1) مراحل انجام آزمون
مرحله Shaping: روز اول و دوم، موشها به صورت گروهی (دستجات 3 تا 5 تایی) در محفظه مرکزی ماز قرار داده میشدند و میتوانستند طی مدت 10 دقیقه غذا را که در نواحی مختلف بازوها گذاشته شده بخورند. روز سوم و چهارم، هر موش به تنهایی در محفظه مرکزی ماز قرار داده میشد و غذا در انتهای بازوها قرار میگرفت. مدت زمان این مرحله برای هر موش 5 دقیقه بود.
مرحله Training: غذا به مدت 12 روز فقط در 4 بازوی مشخص قرار میگرفت. به هر موش حداکثر 5 دقیقه زمان برای حرکت در ماز و خوردن غذا داده میشد. ورود به بازوی فاقد غذا، خطای حافظه مرجع و ورود مجدد به بازوی فاقد غذا یا بازویی که غذای آن خورده شده بود، خطای حافظه کاری محسوب میگردید. پس از اتمام این مرحله برای بررسی نقش رسپتورهای NMDA و رسپتورهای موسکارینی، در پایان دورههای سه روزه نیم ساعت قبل از آزمون ماز شعاعی یکی از غلظتهای MK-801 (آنتاگونیست گیرندهNMDA ) یا اسکاپولامین را به صورت داخل صفاقی در نوبتهای متغییر (counterbalance order) دریافت میکردند.
3-6) آنالیز آماری
در گروههای مختلف برابری واریانسها با آزمون Leven و نرمال بودن دادهها با آزمون Shapiro wilkبررسی گردید. در صورت برابر بودن واریانسها و نرمال بودن داده‌ها از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه ANOVAبا آزمون تعقیبی Tukeyو یا آزمونt-test، در صورت برابر نبودن واریانسها و نرمال بودن داده‌ها از تست Tamhaneو در صورت نرمال نبودن داده‌ها از تست غیر پارامتریک Mann-whitney برای مقایسه میانگین‌ها استفاده شد.
فصل چهارم
4- نتایج
4-1) تاثیر کورپیریفاس بر کیندلینگ
نتایج این تحقیق نشان داد دریافت کورپیریفاس در ابتدای دوره پس ازتولد، درجه تشنج در طی دوره کیندلینگ را به طور معنیداری در موشهای صحرایی نر تغییر نمیدهد (نمودار 4-1).
در موشهای صحرایی ماده، درجه تشنج در گروه دریافتکننده کورپیریفاس در روزهای 4 و 6 کیندلینگ به طور معنیداری کمتر از گروهDMSO بود(p<0.05) (نمودار 4-2).

نمودار4-1) مقایسه میانگین درجه تشنج بین گروههای کورپیریفاس و DMSO در روزهای مختلف القاء کیندلینگ در موشهای صحرایی نر. تفاوت معنیدار بین دو گروه مشاهده نشد.

نمودار4-2) مقایسه میانگین درجه تشنج بین گروههای کورپیریفاس و DMSO در روزهای مختلف القاء کیندلینگ در موشهای صحرایی ماده.P<0.05* در مقایسه با گروه DMSO.
4-2) آزمون یادگیری فضایی
روزدوازدهم آزمون ماز شعاعی تعداد خطای حافظه مرجع در نرهای گروه کورپیریفاس کاهش معنیداری را از نظر آماری درمقایسه با گروهDMSO نشان داد (p<0.05)(نمودار 4-3). تعداد خطای حافظه مرجع در مادههای گروه کورپیریفاس، تفاوت معنیداری را از نظر آماری درمقایسه با گروه DMSOنشان نداد (نمودار 4-4). تعداد خطای حافظه کاری در نرهای گروه کورپیریفاس، اختلاف معنیداری را از نظر آماری درمقایسه با گروهDMSO نشان نداد (نمودار4-5). تعداد خطای حافظه کاری در مادههای گروه کورپیریفاس، روز یازدهم افزایش معنیداری را از نظر آماری درمقایسه با گروه DMSO نشان داد (p<0.05)(نمودار4-6). در این مطالعه، پارامترهای مربوط به میزان سنجش حافظه فضایی بعد از تزریق غلظتهای مختلف داروهای اسکاپولامین و MK-801 در گروههای کورپیریفاس و DMSO مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. آنالیز دادههای به دست آمده از تعداد خطاهای حافظه مرجع نرها در گروه کورپیریفاس با تزریق غلظتهای مختلف اسکاپولامین تفاوت معنیداری را نسبت به سالین نشان نداد (نمودار4-7). همچنین تزریق غلظتهای مختلف اسکاپولامین به مادههای گروه کورپیریفاس نیز تفاوت معنیداری را درتعداد خطای حافظه مرجع نسبت به سالین ایجاد نکرد (نمودار4-8). تعداد خطای حافظه مرجع نرها در گروه کورپیریفاس با تزریق غلظت 2/0 میلیگرم بر کیلوگرمMK-801 افزایش معنیداری را نسبت به سالین نشان داد (p<0.05)، اما غلظت 1/0میلیگرم بر کیلوگرم این دارو تفاوت معنیداری نسبت به سالین ایجاد نکرد (نمودار4-9). تعداد خطای حافظه مرجع مادهها در گروه کورپیریفاس با تزریق غلظت 2/0 میلیگرم بر کیلوگرمMK-801 افزایش معنی داری را در مقایسه با شرایط دریافت سالین و نیز با گروه DMSO نشان داد (p<0.05)، اما دریافت غلظت 1/0 میلیگرم بر کیلوگرم آن تفاوت معنیداری نسبت به سالین ایجاد نکرد (نمودار4-10).
تعداد خطای حافظه کاری نرها در گروه کورپیریفاس با تزریق غلظت 12/0 میلیگرم بر کیلوگرم اسکاپولامین افزایش معنیداری نسبت به سالین نشان داد (p<0.05)، در حالیکه بهدنبال تزریق غلظت 24/0میلیگرم بر کیلوگرم اسکاپولامین این تفاوت معنی دار نبود (نمودار4-11). تعداد خطاهای حافظه کاری مادهها در گروه کورپیریفاس با تزریق غلظتهای مختلف اسکاپولامین تفاوت معنیداری نشان نداد (نمودار4-12). تعداد خطای حافظه کاری نرها در گروه کورپیریفاس با تزریق غلظت 2/0 میلیگرم بر کیلوگرم MK-801افزایش معنیداری نسبت به سالین نشان داد (p<0.05)، اما غلظت 1/0 میلیگرم بر کیلوگرم این دارو تفاوت معنیداری ایجاد نکرد (نمودار4-13). تعداد خطای حافظه کاری مادهها در گروه کورپیریفاس با تزریق غلظت 2/0 میلیگرم بر کیلوگرمMK-801 افزایش معنیداری را نسبت به سالین و گروهDMSO نشان داد (p<0.05)، اما غلظت 1/0 میلیگرم بر کیلوگرم این دارو تفاوت معنیداری ایجاد نکرد (نمودار4-14).
دریافت کورپیریفاس در ابتدای دوره پس از تولد، شاخص حافظه موشهای صحرایی نر را در روز سوم (p<0.01) و نیز در روزهای پنجم، هفتم و دوازدهم نسبت به گروه DMSO بهطور معنیداری افزایش داد (p<0.05)(نمودار4-15). دریافت کورپیریفاس در ابتدای دوره پس از تولد شاخص حافظه موشهای صحرایی ماده را در روز یازدهم به طور معنیداری نسبت به گروه DMSO افزایش داد (p<0.05)(نمودار4-16). تزریق غلظت 24/0 میلیگرم بر کیلوگرم اسکاپولامین، شاخص حافظه در نرهای هردو گروه دریافت کننده کورپیریفاس و DMSO بطور معنیداری نسبت به شرایط دریافت سالین کاهش داد (p<0.05)(نمودار4-17). شاخص حافظه در مادههای گروه کورپیریفاس با تزریق غلظت های 12/0 و 24/0میلیگرم بر کیلوگرم اسکاپولامین کاهش معنیداری را نسبت به گروه DMSO نشان داد (p<0.05) (نمودار4-18). شاخص حافظه درنرهای گروه کورپیریفاس با تزریق غلظت 2/0 میلیگرم بر کیلوگرمMK-801 کاهش معنیداری را نسبت به سالین نشان داد (p<0.01). همچنین شاخص حافظه در گروه DMSO نیز با تزریق غلظت 2/0 میلیگرم بر کیلوگرم کاهش معنیداری را نسبت به سالین نشان داد (p<0.01)(نمودار4-19). شاخص حافظه درمادههای گروه کورپیریفاس با تزریق غلظت 2/0میلیگرم بر کیلوگرم MK-801 کاهش معنیداری را نسبت به گروه DMSO(p<0.05) و شرایط دریافت سالین نشان داد (p<0.01) و با غلظت 1/0میلیگرم بر کیلوگرم این دارو نیز کاهش نسبت به گروه DMSO معنیدار بود (p<0.05)(نمودار4-20).

نمودار4-3) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی نر در روزهای مختلف بین گروههای کورپیریفاس و DMSO.P<0.05* در مقایسه با گروه DMSO.
نمودار4-4) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی ماده در روزهای مختلف بین گروه های کورپیریفاس و DMSO.

نمودار4-5) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی نر در روزهای مختلف بین گروههای کورپیریفاس و .DMSO

نمودار4-6) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی ماده در روزهای مختلف بین گروههای کورپیریفاس و DMSO.P<0.05 * در مقایسه با گروه DMSO.

نمودار 4-7) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی نر در اثر تزریق غلظت های مختلف اسکاپولامین در گروههای کورپیریفاس و DMSO.

نمودار4-8) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی ماده در اثر تزریق غلظت های مختلف اسکاپولامین در گروههای کورپیریفاس و DMSO.

نمودار4-9) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی نر در اثر تزریق غلظت های مختلف MK-801 درگروههای کورپیریفاس وDMSO.P<0.05 * در مقایسه با سالین.

نمودار4-10) مقایسه میانگین خطاهای حافظه مرجع موشهای صحرایی ماده در اثر تزریق غلظتهای مختلف MK-801 در گروههای کورپیریفاس وDMSO.P<0.05* در مقایسه با سالین# P<0.05. در مقایسه با گروهDMSO.

نمودار4-11) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی نر در اثر تزریق غلظت های مختلف اسکاپولامین در گروههای کورپیریفاس و DMSO.P<0.05* در مقایسه با سالین.

نمودار4-12) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی ماده در اثر تزریق غلظتهای مختلف اسکاپولامین بین گروههای کورپیریفاس و DMSO.

نمودار4-13) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی نر در اثر تزریق غلظت های مختلفMK-801بین گروههای کورپیریفاس و DMSO.P<0.05 * در مقایسه با سالین.

نمودار4-14) مقایسه میانگین خطاهای حافظه کاری موشهای صحرایی ماده در اثر تزریق غلظتهای مختلفMK-801 بین گروههای کورپیریفاس و DMSO.P<0.05 * در مقایسه با سالین#P<0.05 . در مقایسه با گروهDMSO.

نمودار4-15) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی نر در روزهای مختلف بین گروه کورپیریفاس و DMSO.P<0.05 * در مقایسه باگروه.DMSOp<0.01** در مقایسه با گروه .DMSO

نمودار4-16) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی ماده در روزهای مختلف بین گروه کورپیریفاس و DMSO.P<0.05* در مقایسه با گروهDMSO.

نمودار4-17) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی نر متعاقب تزریق غلظتهای مختلف اسکاپولامین در گروههای کورپیریفاس و DMSO.P<0.05 * در مقایسه باسالین#P<0.05. در مقایسه با گروهDMSO.

نمودار4-18) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی ماده متعاقب تزریق غلظت های مختلف اسکاپولامین در گروههای کورپیریفاس و DMSO.# P<0.01 در مقایسه با گروه DMSO.
نمودار4-19) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی نر متعاقب تزریق غلظتهای مختلفMK-801در گروههای کورپیریفاس و DMSO.P<0.05 * در مقایسه با سالین.p<0.01 ** در مقایسه با سالین.# P<0.05در مقایسه با گروهDMSO.
نمودار4-20) مقایسه میانگین شاخصهای حافظه موشهای صحرایی ماده متعاقب تزریق غلظتهای مختلف MK-801 در گروههای کورپیریفاس و DMSO.p<0.01 ** در مقایسه با سالین. # P<0.05 در مقایسه با گروهDMSO.فصل پنجم
5- بحث و نتیجهگیری
5-1) بحث
نتایج این تحقیق نشان داد تزریق غلظت 1 میلیگرم بر کیلوگرم کورپیریفاس در روزهای4-1 پس از تولد به نوزادان موش صحرایی، القاء کیندلینگ در ابتدای دوره بلوغ در موشهای نر را بطور معنیداری تحت تاثیر قرار نمیدهد در حالیکه در موشهای ماده در روزهای 4 و 6 از دوره کیندلینگ میانگین شدت تشنجات در مقایسه با گروه DMSO کاهش معنیداری نشان داد. مطالعات قبلی نشان دادهاند دریافت کورپیریفاس با غلظت و دوره تیمار مشابه مطالعه حاضر اگرچه تغییر معنیداری در میزان فعالیت آنزیم استیلکولین استراز ایجاد نمیکند ولی اثرات متعدد در مقیاس سلولی، سیستمیک و حتی کارکردهای رفتاری به دنبال دارد (Qiao et al., 2003; Slotkin et al., 2008) اثرات متعدد سیستمیک و رفتاری ناشی از مجاورت با کورپیریفاس در دوره تکوین به تغییرات دراز مدت و گسترده در سیستمهای نوروترنسمیتری مختلف بویژه سیستم کولینرژیک و سروتونرژیک نسبت داده شده است (Aldridge et al., 2005; Slotkin et al., 2001, 2008). Slotkin و همکاران در سال 2001 نشان دادند، تزریق غلظت 1 میلیگرم بر کیلوگرم کورپیریفاس به نوزادان موش صحرایی در روزهای 4-1 پس از تولد به طور مشخصی باعث کاهش فعالیت استیلکولینترانسفراز (بعنوان یک شاخص پایانههای کولینرژیک) و اتصال همیکولینیوم (بعنوان شاخص عملکردی فعالیت کولینرژیک) در نواحی مختلف مغزی از جمله هیپوکامپ، مغز میانی، استریاتوم، ساقه مغز و کورتکس میشود. در تحقیق مذکور علاوه بر تفاوت در میزان آسیب سیناپسهای کولینرژیک در نواحی مختلف، اثرات وابسته به جنس نیز مشاهده شد از جمله اینکه در موشهای صحرایی ماده آسیب در مارکرهای کولینرژیک در استریاتوم (اولین بخشی که تفاوت جنسیتی را نشان داد) در مقایسه با نرها شدیدتر بود. همچنین Slotkin و همکاران در سال 2008 نشان دادند، تزریق غلظتهای پائین کورپیریفاس در ابتدای دوره پس از تولد به نوزادان موش صحرایی منجر به کاهش در Nerve growth factor (NGF)، Brain derived neurotrophic(BDNF) وFibroblast growth (FGF) میشود که در اختلال در تمایز نورونی بویژه تمایز نورونهای کولینرژیک، نقص در رشد مغزی و پلاستیسیتی سیناپسی و نیز بروز بیماریهای نورودژنراتیو و صرع دخیل دانسته شده است.
مشارکت سیستم کولینرژیک در فرایند کیندلینگ نشان داده شده است. پیلوکارپین (آگونیست رسپتورهای موسکارینی استیلکولین) فرایند کیندلینگ و جوانهزنی فیبرهای خزهای را تسهیل میکند درحالیکه اسکاپولامین (آنتاگونیست رسپتورهای موسکارینی استیلکولین) فرایند کیندلینگ را به تاخیر انداخته و جوانهزنی فیبرهای خزهای را مهار میکند (Adams et al., 2002). همچنین مشخص شده است که کاهش NGF باعث مهار شکل گیری کیندلینگ و جوانهزنی فیبرهای خزهای میشود (Adams et al., 1997). با توجه به شواهدی که تائید میکنند دریافت کورپیریفاس در ابتدای دوره پس از تولد نقائص ساختاری و عملکردی سیستم کولینرژیک و نیز کاهش فاکتورهای تروفیک بویژه NGF را باعث میشود احتمالاً این تغییرات، در کاهش درجه تشنج طی کیندلینگ و تاخیر در بروز آن نقش دارند. با توجه به اینکه اثرات تخریبی کورپیریفاس بر سیستم کولینرژیک در موشهای صحرایی ماده شدیدتر بوده است این مکانیسم ممکن است در تاثیر وابسته به جنس کورپیریفاس بر فرایند کیندلینگ نیز دخیل باشد.
تاثیر دریافت کورپیریفاس در روزهای اول پس از تولد بر کیندلینگ در زمان بلوغ تاکنون مطالعه نشده است بااینحال در تنها گزارش موجود از تاثیر کورپیریفاس بر کیندلینگ در موشهای نابالغ این ترکیب اثر تسهیلی بر کیندلینگ نشان داده است.Wurpel و همکاران در سال 1993 نشان دادند تزریق زیر پوستی کورپیریفاس در محدوده غلظت mg/kg10-3/0 به موشهای 16 یا 17 روزه بطور وابسته به غلظت کیندلینگ الکتریکی آمیگدال را تسهیل میکند که تائید کننده افزایش تحریکپذیری آمیگدال در حضور کورپیریفاس است. در مطالعه مذکور تاثیر حاد دریافت کوپیریفاس بر کیندلینگ الکتریکی آمیگدال مطالعه شده بعلاوه تاثیر عمده تسهیلی کورپیریفاس بر کیندلینگ در محدوده غلظتهایی که مهار قابل توجه آنزیم استیلکولین استراز رخ میدهد مشاهده شد درحالیکه در مطالعه حاضر اثرات درازمدت دریافت غلظت پائین کورپیریفاس (که مهار قابل توجه آنزیم استیلکولیناستراز را به دنبال ندارد) بر کیندلینگ شیمیایی بررسی شده است که میتواند مبنای تفاوت تاثیر بر فرایند کیندلینگ در دو مطالعه باشد.
مطالعه یادگیری فضایی موشهای کیندل شده نشان داد تعداد خطای حافظه مرجع در موشهای نر گروه کورپیریفاس در روز دوازدهم بطور معنیداری از گروه DMSO کمتر است .در حالیکه تعداد خطای حافظه مرجع در موشهای ماده تفاوت معنی داری را نشان نداد. تعداد خطای کاری موشهای ماده در روز یازدهم افزایش معنیداری نسبت به گروه DMSO نشان داد در حالیکه تعداد خطای حافظه کاری در موشهای نر معنی دار نبود. شاخص حافظه نرهای گروه کورپیریفاس در روزهای3، 5، 7 و 12 افزایش معنیداری نسبت به گروه DMSO نشان داد. شاخص حافظه مادههای گروه کورپیریفاس در روز یازدهم نسبت به گروه DMSO کاهش معنی داری داشت. Levin و همکارانش در سال 2001 گزارش کردند، تزریق غلظت 1 میلیگرم بر کیلوگرم کورپیریفاس در روزهای 4-1 پس از تولد به نوزادان موش صحرایی باعث تخریب حافظه فضایی میشود به این صورت که موشهای صحرایی ماده که در اوایل دوران پس از تولد در معرض کورپیریفاس قرار گرفته اند،کاهش در خطای حافظه مرجع و کاری در ماز نشان دادند، در مقابل، موشهای صحرایی نر گروه کورپیریفاس افزایشی در میزان خطا در طی مراحل آزمون داشتند. کورپیریفاس ممکن است از طریق مکانیسمهای غیرکولینرژیک شامل مداخله کردن در تکثیر و تمایز سلولی، بر هم زدن الگوی اکسوژنز و سیناپتوژنز و درنهایت نقص در عملکرد سیناپسها، باعث برهم زدن عملکرد مغز شود.