عضو شوید
عضویت سریع
تبادل لینک هوشمند 
آمار مطالب
آمار بازدید
3-3-3-1 تهیه محلول پایه BAP ………………………….……………………… 32
3-3-3-2 تهیه محلول پایه كينتين …………………………….…………………… 32
3-3-3-3 تهیه محلول پایه2,4-D …………………………….………………….. 32
3-3-3-4 تهیه محلول پایه NAA……………………………..…………………… 32
3-3-4 آمادهسازی محیط کشتهای مختلف ………………….……………………… 32
3-3-4-1 آماده سازی محیط کشت جامد ……………………………….…………… 34
3-3-4-2 آماده سازی محیط کشت مایع …………………………….……………… 34
3-3-5 تهيه و سترون سازي ريزنمونههاي بهليمو ……………………………………. 34
3-3-6 كشت ريزنمونههاي بهليمو ……………………………………………….. 35
3-3-7 روش يادداشتبرداري و صفات مورد مطالعه …………………………………. 35
3-3-8 تجزیه و تحليل آماری …………………………………………………… 36
3-4 كشت آزمايش مزرعه‌اي بهليمو ………………………………………………. 36
3-4-1 آمادهسازي مزرعه ……………………………………………………….. 36
3-4-2 آزمايش خاك …………………………………………………………… 37
3-4-3 تهيه و انتقاال نهالهاي بهليمو ……………………………………………… 37
3-4-5 آبياري مزرعه …………………………………………………………… 37
3-4-6 اعمال تيمارهاي كودي ……………………………………………………. 37
3-4-7 يادداشتبرداري صفات مورد مطالعه ………………………………………… 38
3-4-8 روش برداشت و خشككردن بهليمو …………………………..……………. 38
3-4-9 اسانسگيري …………………………………………………………… 39
3-4-10 تجزيه و تحليل آماري طرح مزرعه …………………………………………. 40
فصل چهارم: نتايج و بحث 4-1 نتایج حاصل از کشت ریزنمونههای بهليمو برروي محیط کشتهاي MS حاوی 4 نوع ترکیب هورمونی NAA و BAP …………………………………………..……………… 41
4-2 نتایج حاصل از کشت ریزنمونههای بهليمو برروي محیط کشتهاي MS حاوی 6 نوع ترکیب هورمونی NAA و 2,4-D وBAP و كينتين …………………………………………… 45
4-3 نتایج حاصل از کشت ریزنمونههای بهليمو برروي محیطکشتهاي MS حاوی 5 نوع ترکیب هورمونی NAA و BAP ………………………………………………..………… 48
4-4 نتایج بهترین حالتهای کشت بافت برای گیاه بهلیمو در شرایط آزمایشگاهی…………………. 52
4-5 نتایج حاصل از بررسی تاثیر كودي بر عملكرد و خصوصيات مورفولوژيكي بهليمو در شرايط مزرعه ………………………………………………………………………. 52
4-4-1 آزمون خاك …………………………………………………………… 52
فصل پنجم: نتيجه‌گيري 5-1 نتیجه‌گیری و جمع‌بندی …………………………………………………….. 55
5-2 نتایج آزمایش‌های درون شیشه‌ای …………………………………………….. 55
5-2-1 آزمایش اول …………………………………………………………… 55
5-2-2 آزمایش دوم …………………………………………………………… 58
5-2-3 آزمایش سوم …………………………………………………………… 60
5-3 آزمایش مزرعه‌ای …………………………………………………………. 61
5-4 پيشنهادات ……………………………………………………………….. 63
فهرست منابع ………………………………………………………………… 64
چکیده انگلیسی ………………………………………………………………. 69
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1 نوع و غلظت ترکیبات بکاررفته در محیط کشتهای مورد استفاده در تحقیق …….. 31
جدول 3-2 مواد تشکیلدهنده محلولهای پایه جهت تهیه محیط کشت MS بههمراه ویتامینهای B5 ………………………………………………………………………… 33
جدول 4-1 نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر زمان يادداشتبرداري و ترکیبات هورمونی محیط کشت و اثرات متقابل این عوامل بر میزان ریشهزایی، ساقهزايي، کالوسزایی، زندهماني، تغييررنگ و تغيير شكل گیاه بهليمو ………………………………………… 41
جدول 4-2 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر زمان يادداشتبرداري بر واكنش ریزنمونههای بهليمو به روش آزمون LSD…………………………………………. 42
جدول 4-3 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر واكنش ریزنمونههای بهليمو به روش آزمون LSD………………………………………….. 42
جدول 4-4 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر متقابل زمان يادداشتبرداري و ترکیبات هورمونی محيطكشت در واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD……………….. 44
جدول 4-5 نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر زمان يادداشتبرداري و ترکیبات هورمونی محیط کشت و اثرات متقابل این عوامل بر میزان ریشهزایی، ساقهزايي، کالوسزایی، زندهماني، تغييررنگ و تغيير شكل گیاه بهليمو ………………………………………… 45
جدول 4-6 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر زمان يادداشتبرداري بر واكنش ریزنمونههای بهليمو به روش آزمون LSD…………………………………………. 46
جدول 4-7 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر واكنش ریزنمونههای بهليمو به روش آزمون LSD …………………………………………. 46
جدول 4-8 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر متقابل زمان يادداشتبرداري و ترکیبات هورمونی محيطكشت در واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD………………. 48
جدول 4-9 نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر زمان يادداشتبرداري و ترکیبات هورمونی محیط کشت و اثرات متقابل این عوامل بر میزان ریشهزایی، ساقهزايي، کالوسزایی، زندهماني، تغييررنگ و تغيير شكل گیاه بهليمو ……………………………………….. 49
جدول 4-10 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر زمان يادداشتبرداري بر واكنش ریزنمونههای بهليمو به روش آزمون LSD………………………………………….. 49
جدول 4-11 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی تاثیر ترکیبات مختلف هورمونی بر واكنش ریزنمونههای بهليمو به روش آزمون LSD…………………………………………… 50
جدول 4-12 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر متقابل زمان يادداشتبرداري و ترکیبات هورمونی محيطكشت در واكنش ريزنمونههاي بهليمو به روش آزمون LSD……………….. 51
جدول 4-13 جدول مربوط به آزمون خاك قبل و بعد از اعمال تيمارهاي كودي ……………. 53
جدول 4-14 نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر تيمارهاي مختلف كود ازت و NPK بر عملكرد و تعدادي از خصوصيات مورفولوژيكي گیاه بهليمو …………………………… 54
جدول 4-15 نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر تيمارهاي مختلف كودي بر روي تعدادي از خصوصيات مورد بررسي گياه بهليمو به روش آزمون LSD………………………….. 54
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شكل 1-1 نمایی از گياه بهليمو به همراه گل‌های سفید…………………………………….. 5
شکل 1-2 فرمول شیمیایی برخی از مواد تشکیل دهنده‌ی اسانس بهلیمو …………………… 12
شکل 3-1- تهيه‌ي و آمادهسازی هورمون‌ها جهت اضافه کردن به محیط کشتهای جامد و مایع… 32
شکل 3-2 کشت بهلیمو در محیط‌های کشت مایع و جامد ……………………………… 34
شکل 3-3- كشت بهليمو در شيشه‌هاي کشت .………………………………………. 35
شکل 3-4 زمان يادداشتبرداري از ریزنمونههای رشد یافته بهليمو ….…………………… 36
شکل 3-5 بستر آماده شده جهت کشت بهلیمو پس از شخم زدن مزرعه …………………… 37
شکل 3-6 نمایی از کرتهای مختلف بهلیمو پس از استقرار در مزرعه …………………… 38
شکل 3-7 يادداشتبرداري صفات مورد مطالعه بهلیمو در کرتهای حاوی تیمارهای مختلف کودی ………………………..……………………………………………… 38
شکل 3-8 برداشت بهلیمو به صورت شاخه بریده و برگ‌های خشک شده ………………… 39
چکیده
جنس Lippia داراي بيش از 200 گونه است كه در اين بين گونه Lippia citriodora L. داراي ارزش بالاي دارويي ميباشد. اين گياه به دليل اهميت فراوان اقتصادي در صنايع غذايي، داروسازي و عطرسازي در قسمت‌هاي مختلفي از ايران كشت و كار ميشود و گونههاي بومي نيز از جنس Lippia در مناطق گرمسيري و نيمهگرمسيري كشور وجود دارد. بدين منظور دو آزمايش جداگانه در شرايط درون شيشهاي و مزرعه‌اي انجام شد. در شرایط آزمایشگاهی سه آزمايش جداگانه با استفاده از طرح کاملا تصادفی با 4 تکرار انجام شد و در آن اثر 13 تیمار مختلف هورمونی (BAP، NAA، 2,4-D و كينتين) و اثر زمان بر میزان كالوس‌زايي و باززایی ريزنمونههاي بهليمو بررسی گردید. با توجه به نتایج تجزيه واریانس در آزمايش درون شيشهاي در غلظتهای مختلف هورمونی، صفتهای ریشهزایی، ساقهزایی، کالوسزایی، تغییررنگ، تغییرشکل در سطح يك درصد معنی‌دار شدند. در مقايسه‌ي ميانگين بين تيمارهاي مورد بررسي مشخص شد كه محیط کشت MS12 حاوي 3/0 ميلي‌گرم بر ليتر اكسين NAA بدون سيتوكنين براي صفت‌هاي ريشه‌زايي، كالوس‌زايي، زندهماني، تغيير رنگ و تغييرشكل به‌ترتيب با 8/63، 6/91، 100، 2/97 و 2/92 درصد بهترين تيمار هورمونی بود، ولي در مورد ساقهزايي، محيط كشت MS بدون هورمون با 3/68 درصد بيشترين تعداد نوساقه‌ها را ایجاد نمود. در آزمايش مزرعه‌اي نیز از بين چهار سطح كودي مختلف شامل صفر، 50 و 100 كيلوگرم در هكتار ازته و غلظت سه در هزار NPK بر روي صفات مورفولوژيكي و ميزان عملكرد گياه بهليمو، تيمار 50 كيلوگرم در هكتار كود ازته بهترين نتايج را در بر داشت.
کلید واژه: بهلیمو، كالوس‌زايي، ساقهزايي، ريشه‌زايي، ترکیبات هورمونی، کود ازته.
فصل اول
مقدمه و کلیات
1-1 گياهان دارويي
1-1-1 اهميت كشت گياهان دارويي
با ظهور داروهاي شيميايي و بيولوژيك، نقش و اهميت گياهان دارويي در تأمين سلامت بشر، در معرض فراموشي قرار گرفت. اما با گذشت زمان، استقبال از گياهان دارويي با رشد قابل توجهي روبرو شده است. بهنظر ميرسد مردم جهان از يك سري نارساييهاي طب مدرن خسته شدهاند و بهطور روز افزون به‌سمت داروهاي گياهي روي ميآورند. اصولاً زماني كه قانون ابنسينا را در غرب به آتش كشيدند و ادعا كردند شيمي، مولكول و فيزيولوژي را شناختهاند، طب به انحراف كشيده شد. بهطوري كه هماكنون طب مدرن توانايي حل بسياري از مشكلات بشر را ندارد و طي سالهاي اخير در كتب درسي به اين موضوع اعتراف كردهاند. بههمين دليل، امروزه حدود 50 درصد داروهاي توليد شده در جهان منشاء طبيعي دارند كه با تغييراتي بهعنوان دارو مورد استفاده قرار ميگيرند. كه نيمي از اين مقدار از منابع معدني، حيواني و باكتريايي بدست ميآيد و نيمي ديگر منشاء گياهي دارد. براي مثال، تمام هورمونهاي مصرفي گياهي هستند و از گياهان مختلفي نظير سيبزميني مكزيكي، شنبليله و غيره بهدست ميآيند. همچنين تركيباتي مثل وينبلاستين و وينكريستين كه از داروهاي ضدسرطان هستند از گياه بدست ميآيند و يا گليكوزيدهاي قلبي از جمله اين گروه داروها محسوب ميشوند (قاسمي دهكردي و همكاران، 1380).
گياهان دارويي يكي از مهمترين منابع دارويي ميباشند كه از هزاران سال پيش كاربرد داشتهاند. سازمان بهداشت جهاني تخمين زده است كه بيش از 80 درصد از مردم بهصورت سنتي و يا مدرن از گياهان دارويي استفاده ميكنند. بعلاوه برخي از داروهاي شيميايي نيز با الگوبرداري از مواد گياهي ساخته شدهاند (تريپاتي و تريپاتي، 2003).
در قرن اخير دانشمندان به زيانهاي ناشي از سموم شيميايي، مواد افزودني، اسانس و طعمدهندههاي مصنوعي كاملاً پيبردهاند و بروز انواع سرطانها و بيماريهاي مختلف تأييدكننده اين موضوع ميباشند. بر اين اساس كشورهاي پيشرفته كه داراي امكانات تحقيقاتي گستردهاي در مورد شناسايي اين مواد مضر بودهاند، تصميم گرفتهاند كه در چند سال اخير كليهي مواد مصرفي شيميايي را از مواد غذايي، دارويي، آرايشي و بهداشتي بتدريج حذف نموده و بجاي آن از منابع گياهي استفاده كنند .كشور ما داراي غنيترين منابع گياهي از نظر مقدار و تنوع در سطح جهان ميباشد .هماكنون كشورهاي پيشرفته پي به ارزش گياهان دارويي و صنعتي برده و درصدد كشت و پرورش آنها در ساير كشورهاي فقير شدهاند. شناسايي گياهان اسانسدار گامي مهم در جهت اهلي كردن و ترويج شيوههاي صحيح بهرهبرداري و استفاده از اين گياهان ميباشد. گياهان دارويي اسانسدار نقش مهمي در زندگي انسان دارند و در ايران از سابقه طولاني برخوردار ميباشند (موسويان و بصيري، 1378).
در گذشته گياهان دارويي جمعآوري شده از طبيعت براي رفع نيازهاي بازار كافي بود، طي ساليان گذشته تعدادي از گونههاي پرمصرف در خطر انقراض قرار گرفتهاند، براي رفع نيازهاي فزاينده به داروهاي گياهي، گياهان بايستي كشت شوند، علاوه بر اطمينان از منابع كافي كشت گياهان دارويي باعث توليد مواد خام دارويي با كيفيت يكنواخت و خصوصيات شناخته شده ميگردد. از سوي ديگر تامين مواد اوليه براي صنايع داروسازي نياز به افزايش توليد محصول در واحد سطح دارد كه علميترين و اقتصاديترين روش دستيابي بهاين مهم افزايش كارايي نهادههاي مورد استفاده در زراعت گياهان دارويي ميباشد (توماس، 2000).
كشت يك گياه دارويي از نظر اقتصادي وقتي مقرون بهصرفه است كه متابوليتهاي ثانويه آن بهحد مطلوب رسيده باشد، با شناخت عوامل محيطي موثر در توليد و انتخاب ارقام گياهي مناسب ميتوان بهحد اكثر مقدار محصول دست يافت (اميدبيگي، 1386). در مناطقي مثل ايران وجود نور فراوان يكي از منابع مهم و بالقوه در توليد گياهان دارويي است كه بايد يا مناسبترين روشها از آن استفاده كرد (اميدبيگي، 1386). در شرايطي كه هيچگونه محدوديت عوامل محيطي وجود نداشته باشد، توليد ماده خشك گياهي با مقدار نور جذب شده متناسب است (مونتيس، 1994).
1-1-2 تاريخچه گياهان دارويي
با نظري اجمالي به فرهنگ مصرف داروهاي گياهي در ايران میتوان متوجه ميراث با ارزش اين گياهان در طب غني سنتي ايران شد. از طرفي فلات وسيع ايران از اقليمها و محيطهاي گوناگون برخوردار است، بههمين دليل بيش از 7500 گونه گياهي مختص به ايران است. از اين رو بهحق، فلور ايران يكي از منابع داروخيز جهان محسوب ميشود. از آنجايي كه گياهان وحشي در محدودههاي جغرافيايي گستردهاي يافت ميشود، جمعآوري و دسترسي به آنها از نظر اقتصادي مقرون بهصرف نيست و استفاده از گياهان وحشي جوابگوي صنايع داروسازي نخواهد بود و چنين استفادهي انبوه از گياهان طبيعت مسلماً موجب نابودي آنها خواهد شد. از اين رو نسبت به كشت اين گياهان در سطوح زراعي اقدامات مفيدي در سطح كشور انجام شده است. گزارش شده است كه انسان دير و يا زود چارهاي بهجز بازگشت به طبيعت خود نخواهد داشت. از اين رو، در كشورهاي توسعه يافته اقدامات وسيعي را در توسعه و پيشرفت كشت و استفاده از گياهان دارويي انجام شده است. اميد است در كشور ما با تربيت نيروي متخصص و فرهنگسازي استفاده از گياهان دارويي، از اين نعمت الهي بينصيب نمانيم (ابراهيمپور و عيديزاده، 1388).
ابنسينا، دانشمند و پزشك نامدار ايراني در سالهاي 428-370 هجري مطابق با 980-1037 ميلادي كه در غرب او را بهنام آويسينيا مي‌شناسد و پس از انقراض تمدن يونان او را بزرگ‌ترين دانشمند جهان و به اشتباه، عرب دانستهاند (چون كتابهاي او به عربي نوشته شده است). در جلد دوم كتاب قانون فيالطب بيش از 800 نمونه گياه طبي و غذايي را نام ميبرد كه از آن ميان 541 گياه و مشتقات آنها داراي توصيف كاربردي و صفات ريختشناختي هستند. او اختلاف شكل و صفات گياهان مشابه يا نزديك به هم را (براي اجتناب اشتباه آنها از يكديگر) با توجه خاصي در كتاب “قانون” توضيح ميدهد و در مورد چگونگي استفاده از مشتقات گياهان دارويي و كاربرد آنها، با ترتيبي خاص، معين و نظام يافته به شرح و تفصيل آنها ميپردازد (زارعزاده، 1383).
آلبرت ماگنيوس اين كشيش كه در نوشته‌ها به آلبرت بوستادت بيشتر معروف است، در سالهاي 1193-1280، بعد از ابنسينا و بيروني در ايام و بحران فكري قرون وسطي اروپا، درباره طب و تاريخ طبيعي و همچنين گياهشناسي كتابي به نام رستنيها، دو وژتابليس را نوشت. محتويات و نحوه نگارش اين كتاب، به خوبي نشان ميدهد كه آلبرت كبير نيز تحت تأثير شديد تئوفراست و ديگر دانشمندان و قدماي رم و يونان مورد قبول كليسا قرار داشت و در عين حال، برخي مشاهدات خود را نيز در اين كتاب آورده است (زارعزاده، 1383).
ايرانيان از ديرباز و حتي پيش از ديگران در زمينه گياهان دارويي و كاربرد درماني آنها از دانش پيشرفتهاي برخوردار بودهاند. نمونه بارز آن كتاب باستاني اوستاست .در«ونديداد» يكي از پنج كتاب تشكيلدهنده اوستا (كه در مجموع دستكم 2500 سال پيشينه دارد)، بخشهاي پرشماري به گياه درماني، معرفي گياهان دارويي و كاربرد آنها اختصاص يافته است. اما متأسفانه در لشكركشي اسكندر مقدوني، كتابخانه مشهور اسكندريه در آتشسوزي عمدتاً نابود شد و بيشتر منابع و آثار و كتابهاي جمعآوري شده در آن سوخت و خاكستر شد. بدين ترتيب، سوابق گياهشناسي شرق كهن در دو تمدن ايران و مصر بر اثر اين آتشسوزيها، فاقد هر گونه مدرك ديرينه شناخت گياهان دارويي و خواص آنها گرديد. متأسفانه بعدها نيز بر اثر تخريب قلاع فرقه اسماعيليه و آتش زدن كتابخانههاي آن بوسيله هلاكوخان مغول، بقيه آثار مكتوب گياهان دارويي، كه توسط اين فرقه جمعآوري شده بود، از ميان رفت، تا اينكه در قرن هشتم و نهم ميلادي، اطباء ايراني رونق خاصي به طبابت ايران و جهان بخشيدند. بطوريكه با پيدا شدن دانشمندان و نوابغي نظير ابوعليسينا و محمد زكرياي رازي با انشار كتابهاي معروف خود (قانون و الحاوي) پيشرفتهاي زيادي نصيب ملت ايران و جهانيان گرديد. اين پيشرفتها همچنين در قرون بعد نيز ادامه يافت. در قرن 13 ميلادي، ابنبيطار، اختصاصات متجاوز از 1400 گياه را كه خود شخصاً ميشناخت را در كتابش شرح داد (دوازده امامي، 1386؛ زارعزاده، 1383).
1-2 به ليمو
1-2-1 تاريخچه و معرفي بهليمو
گیاه بهليمو (شکل 1-1) با نام علمی Lippia citriodoraاز خانواده شاهپسند (Verbenaceae) (مظفریان، 1389؛ زرگری، 1375)، این گیاه بومی آمریکاي جنوبی است (زرگری، 1375) و بهنام پزشک گیاهشناسی موسوم به Lippi که در سالهای 1678 تا 1704 میلادی میزیسته و در حبشه بهقتل رسید، نامگذاری شده است (زرگري، 1375). در فرهنگ گیاهدرمانی ایران، برگهاي این گیاه بهصورت دمکردنی بهمنظور آرامبخش، ضدتشنج و برطرفکننده تپش قلب و سرگیجه مصرف دارد (امین، 1388). تا 100 سال پيش فقط بهعنوان يك گونه زينتي شناخته ميشد، ولي امروزه بهدليل اهميت فراوان اقتصادي آن در صنايع غذايي و عطرسازي در اكثر كشورها از جمله در ايران و به ويژه در استان گلستان كشت شده و به خوبي پرورش مييابد. امروزه اين گياه در شمال كشورمان كشت و كار ميشود و گونههاي بومي آن از جنس Lippia در مناطق گرمسيري و نيمهگرمسيري كشورمان وجود دارد (امين، 1370).
شكل 1-1: نمایی از گياه بهليمو به همراه گل‌های سفید
1-2-2 بهليمو (Lemon verbena) از نظر ردهبندي گياهي
بهليمو از سلسلهي Planta، شاخهي Magnoliophyta، ردهي Magnoliopsida، راستهي Lamiales، خانواده Verbenaceae، جنس Aloysia، و گونهي A. triphylla، است(آنونيموس، 2007).
1-2-3 گياهشناسي بهليمو
بهلیمو درختچهای کوچک به ارتفاع تا 90-100 سانتیمتر، با شاخههای شیاردار و کم و بیش زبر برگها در چرخههای 3 یا 4 تایی، سرنیزهای، بهطول 5- 5/7 سانتیمتر، با دمبرگ کوتاه، کامل یا در میانه دندانهدار، بدون کرک، در سطح تحتانی بهانبوهی پوشیده از کرکهای غدهدار (منقوط)، با بوی لیمو سنبلهها چرخهای و محوری یا مجتمع شده در پانیکولهای انتهایی اغلب 3 تایی. گلها سفید، به طول 5/4- 5 میلیمتر، شکوفا و گلدهنده در تابستان و پاییز. کاسه گل به انبوهی کرکدار. لوله جام گل بلندتر از کاسه (زرگري، 1375).
1-2-4 نامهاي ديگر بهليمو
براي بهليمو نامهاي ديگري نيز در منابع ذكر شده است كه به تعدادي از آنها اشاره ميشود.
Lippia citriodora Kunth (آزادبخت، 1378؛ زرگري، 1371؛ كريمي، 1381؛ يزداني و همكاران، 1383) Lippia citriodora H.B.U.K (راشدي، 1380؛ كريمي، 1381)
Lippia triphylla (راشدي، 1380؛ صمصام شريعت، 1374)
Verbena triphylla L Herit (رضايي و همكاران، 1380؛ يزداني و همكاران، 1383)
Aloysia citriodora orteg (رضايي و همكاران، 1380؛ يزداني و همكاران، 1383)
Aloysia triphylla (L “Herit) Britton (راشدي، 1380)
1-2-5 گونههاي ديگر بهليمو
گونههاي مفيد ديگري از اين گياه وجود دارد و در محلهاي رويش، كاربرد درماني دارند كه در زير به طور گذرا به آنها پرداخته شده است:
1-Lippia graveolens H.B.& K : در برزيل و مكزيك ميرويد .تيزان حاصل از آن براي درمان روماتيسم بهكار ميرود.
2-:scaberrima L. Sond در آفريقاي جنوبي ميرويد و بهعنوان بندآورنده و منعقدكننده خون، مصرف ميگردد.
3- Cham microcephala L.: درختچهاي است بومي برزيل كه برگهايي پوشيده از تارهاي غدهاي مملو از اسانس مطبوع و گلهايي سفيدرنگ دارد .بوي آن شبيه بوي آويشن و رومارن است .از آن بهمنظور رفع تشنج و درمان ناراحتيهاي ناشي از گزش مار استفاده ميشود.
4- : geminata L. (Willd citrata L.) درختچهاي است بومي جزاير آنتيل و نواحي مختلف آمريكاي جنوبي كه معادل 123/0 درصد اسانس پك اولت (peck olt) از آن بهدست ميآيد .برگ اين گياه بهصورت دمكرده و در رفع نزله بهكار ميرود.
5- Hochst adoensis L.: در آمريكا ميرويد و از برگ آن براي رفع تب و سرفه استفاده ميشود. داراي اندامهاي معطر و اسانسي با تركيب شيميايي متفاوت برحسب منشأ جغرافيايي است (در محل اصلي رويش، براي آن 4 گونه قائلاند). سرشاخهي گلدار اين گياه بيشتر از سرشاخههاي برگدار آن، اسانس دارد. گلهاي آن معادل 14 تا 15 در هزار اسانس خام با بوي معطر توليد ميكند كه معادل 37 درصد كامفر چپ از آن استخراج ميشود.
6- :Lantana pseudo- theaSt. Hill L.pseudo- Thea درختچهاي است بومي نواحي گرم آمريكا كه بيشتر در مناطق مرتفع برزيل ميرويد. داراي برگهاي متقابل با بوي مطبوع بسيار قوي است. بوميان محل از آن دمكردهاي تهيه ميكنند كه براى رفع تشنج كاربرد دارد (رضايي و همكاران، 1380).
1-2-6 منشأ و پراکنش بهليمو در ايران
بهليمو بيشتر در زمينهاي آفتابگير، با خاك داراي نفوذپذيري (خاك لومي سبك) و رطوبت و آب كافي، رشد مينمايد (زرگري، 1371). اين گياه در برابر سرما و وزش باد شديد حساس است (راشدي، 1380). اين گياه را ميتوان در نواحي مديترانهاي كاشت مانند بخش اعظم كرمانشاه بهجز ناحيهاي محدود در جنوب غربي مانند پاوه، مريوان، اسلام آباد غرب، جوانرود، سرپل ذهاب، قصرشيرين، استان ايلام: گيلان غرب استان لرستان: خرم آباد و جنوب غربي آن، كوهدشت، شمال شرقي خوزستان: ايذه، شمال شرقي، كهكيلويه و بويراحمد: ياسوج، سي سخت، شمال غربي استان فارس: نورآباد ممسني، آباده، بخش اعظم چهارمحال و بختياري: شهركرد، لردگان، فارسان و جنوب غربي چهارمحال و بختياري، استان اصفهان: سميرم، شهرضا و فريدون شهر، ناحيه معتدل بخش اعظم استان مازندران، رامسر، نوشهر، ساري، نور، بهشهر، ناحيهاي محدود در شرق استان گيلان (چابكسر) (مظفريان، 1383).
1-2-7 اهميت اقتصادي بهليمو
گياهان دارويي يكي از منابع غني كشور بوده كه امكان صادرات آن نيز وجود دارد، زيرا وقتي به ارقام واردات كشورهاي اروپايي مثل آلمان و فرانسه توجه نمود، معلوم ميگردد كه گياهان دارويي بازار بزرگي در جهان داشته و كشور ما ميتواند به يكي از مهمترين صادركنندگان اين گياهان تبديل شود. بهليمو برگهاي سبز و روشن با بوي مشابه ليمو دارد (كارنات، 1999). اسانس آن بوي بسیار مطبوع دارد و در تهیه اودوکلن مورد استفاده قرار میگیرد (زرگري، 1375). ضماد له کردهی تازهی آن برای التیام زخم مفید است (حاجيشرفي، 1388). در تجارت گیاه برای تولید اسانس تولید میشود (مظفريان، 1391). باتوجه به بازدهي بالاي بهليمو در سطح و قيمت بالاي برگ خشك اين گياه و اينكه تقاضاي بهليمو در كارخانجات و مصارف عطاري‌هاي در سالهاي اخير بيشتر شده از اينرو توليد و بهرهبرداري از آن در مزارع كشور توجيه اقتصادي دارد.
1-2-8 روش پرورش گياه بهليمو
تكثير بهليمو، به شيوهي قلمهزدن شاخهها، خوابانيدن آنها (راشدي، 1380؛ رضايي و همكاران، 1380؛ زرگري، 1371) يا به وسيلهي پاجوش (راشدي، 1380؛ رضايي و همكاران، 1380) در زمينهاي زراعي نفوذپذير و مرطوب صورت ميگيرد. بهدليل حساس بودن اين گياه در برابر افزايش دما، آبياري زمين زراعي در فصلهاي گرم سال، امري الزامي است (زرگري، 1371؛ گرونوالد، 2004). البته با استفاده از اين روش، تعداد محدودي گياه با توجه به حجم خزانه در دسترس و همچنين تعداد پايههاي مادري اوليه توليد ميشود (امیدبیگی، 1376).
تكثير به وسيلهي قلمه زدن بدين صورت انجام ميگيرد كه شاخههاي جوان گياه را كه در آغاز، رويش طولي دارند از ساقه قطع ميكنند و پس از جدا نمودن برگها، اين قلمههاي خشبي را در بستر يا نهالستان‌هايي كه زمين آن، از قبل آماده گرديده است، كاشته ميشوند. با آبياري مرتب قطعه زمين نهالستان آماده ميگردد، قلمهها به تدريج در پاييز ريشهدار ميشوند و بر اثر رشد و نمو، آمادگي انتقال به زمين زراعي را پيدا ميكنند. دور آبياري هر 5-10 روز يك بار بسته به بافت خاك و اقليم منطقه متفاوت است. زمين زراعي را بايد از قبل به عمق 40 تا 50 سانتيمتر بهخوبي شخم زده و تهيه كرده باشند، در غير اين صورت ريشههاي گياه، نمي‌توانند بهآساني در داخل خاك نفوذ نمايند و رطوبت لازم را بهدست آورند و در خاك استقرار يابند. بر پايه برخي توصيههاي كارشناسي ديگر بايد زمين محل كشت، را در دو نوبت ديگر شخم زد (آخرين نوبت بهمنظور اضافه و مخلوط كردن انواع كودها، بهدرون خاك). پس از انجام اين كارها در سطح زمين زراعي، خطوطي بهفاصلهي يك متر ايجاد و سپس فواصلي بهطول 60 سانتيمتر در آن مشخص مينمايند كه هر يك از نقاط ياد شده محل انتقال يكي از قلمههاي ريشهدار گياه است. پيش از انتقال قلمههاي ريشهدار بهزمين زراعي، آنها را از ناحيهي يك سانتيمتري يقه، قطع ميكنند و ريشههاي دراز شده گياه را نيز كوتاه مينمايند (هرس ريشه يا هابياژ) تا با اين عمل ريشههاي جانبي، سريعتر آمادگي رويش پيدا نمايند. عمل انتقال قلمهها بايد بهخوبي همراه با ضدعفوني قلمهها با يكي از قارچكشهاي مناسب و زير نظر كارشناسان گياهپزشكي يا حفظ نباتات بهوسيله دست صورت گيرد. پس از انجام ضدعفوني و انتقال قلمهها بهداخل خاك، بايد قسمتي از خاك اطراف آنها بر اثر فشار انگشتان بر روي گياه ريشهدار و عاري از ساقه، بهحالت فشرده درآيد تا علاوه بر خروج هواي اضافي (هواگيري) قلمهها بتوانند بهخوبي استقرار يابند. در پاييز پس از انجام مراقبت‌هاي لازم براي نگهداري گياه از عوامل نامساعد محيط خارج، سطح زمين را با قشري از برگهاي خشك مي‌پوشانند و سپس در بهار آنها را از روي قلمهها خارج ميسازند. تمام عمليات مناسب باغباني مانند كوددهي بهموقع بايد پس از آزمون خاك و زير نظر كارشناسان تغذيه و باغباني براي هر هكتار زمين زراعي، حدود 200 كيلوگرم كود ازته نيترات سديم، مقدار 300 كيلوگرم سوپر فسفات و ميزان 100 كيلوگرم كود سولفات پتاسيم بهدقت اعمال گردد. پس از جمعآوري محصول، شاخههاي برگدار گياه را قطع و سپس آنها را بهطور طبيعي بهصورت دستهاي و بهوضع آويزان در انبارهاي ويژهاي نگهداري ميكنند، بهنحوي كه جريان هوا در آن محل بهخوبي برقرار باشد. پس از خشك شدن، برگها را از شاخهها جدا و در گونيهاي كنفي يا پارچهاي 50 تا 70 كيلوگرمي بستهبندي و روانه بازار تجارت مينمايند (زرگري، 1371). حدود 1700 قلمه با فواصل 12-80 × 50-40 سانتيمتر در هكتار ميتوان كاشت. pH بهينه مورد نياز محدوده 7 (يعني تقريباً خاك قليايي يا خنثي) است (مظفريان، 1383).
1-2-9 زمان جمعآوري بهليمو
زمان جمعآوري و چيدن برگها اواخر تابستان است (كريمي، 1381) و 2 تا 3 نوبت در سال و كار چيدن برگها بسته به شرايط اقليمي و وضعيت رشدي گياه بهطور معمول همزمان با ماههاي خرداد، مرداد و مهر است (راشدي، 1380؛ زرگري، 1371؛ يزداني و همكاران، 1383). برداشت بهصورت هرس شاخههاي گياه صورت ميپذيرد. بايد تا حد امكان از شكسته شدن برگها طي عمليات برداشت و خشك كردن جلوگيري شود. ميانگين عملكرد آن 1200 كيلوگرم در هكتار برگ خشك (ميزان اسانس در برگ خشك 2/1 تا 81/0 درصد) است (مظفريان، 1383).
1-2-10 خواص دارويي و كاربردهاي بهليمو
تببر، ضداسپاسم، ضدخستگی بدن، آرامبخش و آرامکنندهی اعصاب است، برای تقویت معده، رفع درد شکم، دلپیچه و کاهش نفخ موثر است، برا رفع تپش قلب، تسکین میگرن، رفع سرگیجه و صداهای داخل گوش مفید میباشد (حاجيشرفي، 1388). بهلیمو خاصیت مسکن ملایم و شهرتی برای آرام کردن ناراحتی‌های شکمی دارد. اثر مقوی آن روی سیستم عصبی با قطعیتی کمتر از فرنجمشک است، با وجود این به شادابی کمک میکند و برعلیه افسردگی موثر است (مظفريان، 1391). از نظر تقویت معده، باید آنرا در ردیف بهترین داروها قرار داد و برای اینمنظور نیز بهتر است همیشه بهصورت دم کرده مانند چای مصرف شود (زرگري، 1375).
تركيب ليمونن مادهي تلخ مركبات و ليمو و داراي اثر سمي و تحريككننده پوست است. ليمونن در فرمول فرآوردههاي دارويي مانند قرص بيكربنات سديم و پمادهاي ضدعفونيكننده وارد، همچنين در ساخت ويتامين A از آن استفاده ميشود. تركيب ليمونن در صنايع عطرسازي، بهمنظور معطر نمودن مواد آرايشي، ساخت صابونهاي رنگي، خوشبوكنندهها، طعمدهندهها، بهعنوان حلال در ساخت رزينها و مرطوب كننده بهكار ميرود (راشدي، 1380).
تركيب 1و 8- سينوئل داراي اثرات كرمكشي، ضدآلرژي، گندزدايي، قارچكشي، باكتريكشي، تسكين‌دهنده، خلطآور، پايينآورندهي فشار خون، جلوگيري از التهاب گلو، التهاب حنجره، تحريك سيستم مركزي اعصاب و توليد صفرا بهوسيلهي كبد و در مواردي سبب قرمز شدن پوست و آلرژيزا است. تركيب ليمونن نيز يك مونوترپن تك حلقهاي با جرم ملكولي 136 بهشكلهاي راست گرد، چپگرد و شكل راسميك و مايعي بيرنگ با بويي شبيه ليمو و در آب غيرقابل حل، ولي در الكل قابل حل است. در مجاورت هوا، يك لايهي اكسيد تشكيل ميدهد و اين لايه رفتاري همانند لاستيك يا روغنهاي خشكشونده دارد (راشدي، 1380). همچنين بهعنوان ادويه در مصارف خانگي براي خوشبو و معطر ساختن گوشت، ماهي، انواع مربا، پوره و غيره بهكار ميرود. اسانس بهليمو، داراي خواص باكتريكشي و حشرهكشي است (كريمي، 1381).
1-2-11 مواد تشكيلدهنده اسانس بهليمو
متابوليتهاي ثانويه، مواد آلي شيميايي پيچيدهاي هستند كه گياهان در طول حيات خود توليد مينمايند، ولي در رشد و نمو و فعاليتهاي حياتي آنها نقشي ندارند و عمدتا بهمنظور دفع آفات، جذب حشرات گردهافشان و مبارزه با بيماريهاي ميكروبي در گياه توليد ميشوند (كومار و گوپتا، 2008). در ايران ميزان اسانس برگ گياه بهليمو 6/0 درصد است. و بهنحو عمده شامل 24 ماده مختلف ميباشد، ليمونن (29.4%) و 1 و 8- سينئول تركيبهاي اصلي ميباشند. ژرانيول، مگاژرانيول و كارمنفنيلاكسيد از ساير تركيبهاي اصلي اسانس ميباشند (مجاب، 1381؛ سارتوراتو، 2004).
مجاب و همكاران (2003)، ترکیبات اسانس برگهاي بهلیموي تهیه شده از عطاري تهران را ژرانیول، نرول، نرال، ژرانیال، لیمونن و 1 و 8- سینئول، اسپاتولنول و آلفاکورکومن گزارش کردند. طی پژوهشی عمده‌ترین ترکیبات اسانس در برگ بهلیمو لیمونن، 1 و 8- سینئول، ژرانیال، نرال، بتا-گوانین، اسپاتولنول و سایوفیلناکسید گزارش شده است (رضایی و جایمند، 2002).
با توجه بهاینکه مهمترین ترکیبات مورد استفاده از اسانس گیاه بهلیمو در صنایع مختلف خصوصاً صنایع دارویی، ژرانیال و نرال میباشد و میزان این ترکیبات بهطور مشخص و فرایندهاي در اسانس استحصالی از بذر این گیاه در مقایسه با سایر اندامها در گزارشهاي یادشده بیشتر است، بنابراین توصیه میشود که با اعمال روشهاي اصلاحی و بهزراعی متعدد که منجر به افزایش تولید بذر و افزایش کمی و کیفی اسانس آن میگردد، منابع گیاهی ترکیبات مذکور را افزایش داد (شاهحسيني و همكاران، 1390).
1-2-12 فرمولهاي شيميايي و شكل نمايي از برخي مواد تشكيل دهندهي اسانس بهليمو
در اسانس حاصل از گياه بهليمو مواد مؤثره فراواني وجود دارد (شکل 1-2) از قبيل ژرانيول با فرمول شيميايي C10H18O، ليمونن كه يكي از اصلي‌ترين مواد ميباشد با فرمول شيميايي C10H16 که یک مایع بی‌رنگ هیدروکربنی از کلاس سیکلوترپن است و معمولاً ایزومر D آن بوی قوی‌ای مانند پرتقال دارد. در سنتزهای شیمیایی بهعنوان پیش ماده‌ای برای Carvone و نیز بهعنوان یک حلال تجدیدپذیر در شوینده‌ها بکار می‌روند. همچنين لينالول و نرول نيز با فرمول شيميايي C10H18O بههمراه بسياري تركيبات ديگر وجود.
ژرانيول ليمونن
نرول لينالول
شکل 1-2 فرمول شیمیایی برخی از مواد تشکیل دهنده‌ی اسانس بهلیمو
1-3 كشت بافت
روشهاي كشت بافت گياهي و بخصوص زمينه تجاري آن كه ريزازديادي ناميده ميشود، از فناوري‌هاي كاربردي با دورنمايي جديد جهت تكثير رويشي گياهان ميباشند كه امكان توليد گياهاني سالم با ژنوتبپ يكسان را فراهم مينمايند. روش ريزازديادي ضريب تكثير بالايي دارد، روند سلكسيون را كوتاه ميكند و عمليات آن با اقتصادي نمودن مكان‌هاي مورد نياز جهت كشت گياهان در تمام طول سال قابل انجام است. در بسياري از كشورهاي دنيا، ريزازديادي گياهان كه از آن تحت عنوان يك صنعت زيستي نام برده ميشود، در مسير صنعتي شدن قرار گرفته است و تاكنون صدها شركت كاري فعال در اين زمينه معرفي گرديده‌اند (قاسمی بزدی و رمضانی مقدم، 1391).
يكي از مزاياي روشهاي ريزازديادي، سرعت تكثير بسيار بالاي گياهان براساس انتقال ماهيانه ريزنمونه‌ها به محيط كشت‌هاي جديد ميباشد و تعداد گياهان توليد شده از هر ريزنمونه را ميتوان در هر سال براساس سرعت‌هاي تكثيري مختلف و واكشت‌هاي ماهيانه در شرايط در شرايط متفاوت كشت و براي گونه‌های مختلف، پيش‌بيني نمود. بهطور مثال با ضريب تكثير دو گياه در ماه، طي يك سال ميتوان حدود 4 هزار گياه از هر ريزنمونه بهدست آورد. با افزايش ضريب تكثير به 3 و 4 گياه در ماه، طي يك سال ميتوان به‌ترتيب به بيش از 500 هزار و 16 ميليون گياه از هر ريزنمونه رسيد (قاسمی بزدی و رمضانی مقدم، 1391).
این فن‌آوری در آغاز قرن بیستم از تفکر دانشمند آلمانی بهنام هابرلند با توجه به خاصیت توتی‌پتنسی سلول منشا گرفت. هابرلند پیشنهاد کرد که بایستی تکنیک‌ها و روش‌هایی برای جداسازی و کشت‌بافت‌های گیاهی با این فرض شکل گیرد که اگر محیط و مواد غذایی سلول‌های کشت شده بهدرستی کنترل شوند آن سلولها به گیاهی طبیعی تبدیل خواهند شد (باقری و صفاری 1386؛ قاسمیبزدی و رمضانیمقدم، 1391). در سال 1934 اولین کشت بافت موفق توسط وایت انجام شد و اولین کشت کالوس موفق هویج و توتون تا سال 1939 توسط وایت گزارش شد (قاسمی بزدی و رمضانی مقدم، 1391).
مفهوم اصلی کشت بافت آن است که کلیه عوامل ضروری لازم برای یک بافت (آنهایی که توسط خود بافت کشت شده تامین نمی‌شود) در یک محیط کشت مصنوعی فراهم آید. از نخستین مواد مهم 16 عنصر ضروری را میتوان نام برد. کربن، هیدروژن و اکسیژن با یک قند و معمولاً با گلوکز یا ساکارز تامین می‌شوند، در حالی که موادغذایی عمده یا پرمصرف (Ca,K,Mg,N,P,S) و موادغذایی کم‌مصرف (Mn,Mo,Zn,B,Cu,Fe) بهصورت نمک‌های معدنی تامین می‌گردند. همغلظت و همتوازن عناصر غذایی برای رشد مناسب بافت در محیط کشت اهمیت دارند. دستورالعمل متعلق به محيط موراشيگ و اسکوگ (MS) است. بیشتر بافت‌های کشت شده نیازمند یک یا چند ویتامین مثل تیامین، پیریدوکسین و نیکوتینیک‌اسید هستند. مواد گوناگون دیگری نیز برای پاسخ‌گویی به نیازهای بافت کشت شده و یا اهداف خاص محقق به محیط‌کشت افزوده میگردد. هورمون‌های گیاهی (اکسین‌ها، سیتوکینین‌ها، جیبرلین‌ها) اغلب مورد استفاده قرار می‌گیرند. معمولاً آگار- آگار یا یک ماده جامد‌کننده مفید دیگر جهت جامدسازی محیط برای حفاظت از گیاه استفاده میشود اگرچه در سالهای اخیر کشت بافت در محیط کشت مایع نیز شایع شده است (توحید‌فر و کاویانی، 1389).
کشت درون شیشه‌ای میتواند بافت یا اندام‌های کامل را در برگیرد و از این رو نیازمند آن است که ساختار بافت واردشونده به محیط حفظ شود و یا میتواند کشت سلولها با تکثیر سازمان نیافته را شامل شود. هدف گزینه‌ی اول معمولاً القاء ساختار تا رسیدن به گیاه کامل است. مثال‌های برجسته‌ی اندام‌های گیاهی معمولاً با دو هدف عمده انجام میشود. هدف اول تحقیق پایه‌ای در جهت درک مکانیسم نمو (مثل جنین‌زایی یا نمو رشته‌های آوندی) از طریق کنترل محیط میباشد. هدف دوم، بدست آوردن گیاهان به گونه‌ای است که با روش‌های معمول امکان‌پذیر نیست (مثل تلاقی‌های دور یا تکثیر کلونی مریستم‌ها). سایر اهداف از طریق کشت تک‌سلول‌ها یا مجموع سلولها برآورده میشود. یک مجموع سلولی تمایزنیافته روی یک محیط‌کشت (نه غوطهور شده) کالوس نامیده میشود (توحید‌فر و کاویانی، 1389).
1-3-1 کشت کالوس
در کشت بافت‌های گیاهی، در اکثر موارد بافت کالوس تولید میشود و بافت‌های غده‌ای بندرت دیده می‌شوند. کالوس یک بافت سازمان نیافته و در حال تقسیم میباشد که از سلول‌های تمایز نیافته‌ای تشکیل شده است. در مراحل بعدی، این سلولها اختصاصی گردیده بهطوری که به کالوس‌هایی تبدیل می‌شوند که از آنها تیپ‌های خاصی متمایز می‌شوند. کالوس میتواند هم بر روی قطعات بافت‌های مجزا (ریزنمونه‌ها) در شرایط درون شیشه‌ای و هم بر روی گیاهان در محل زخم‌های حاصل از برش تولید شود. تشکیل و تکثیر درون شیشه‌ای کالوس با حضور هورمون‌های اکسین و سیتوکینین که تقسیم و طویل شدن سلول را تقویت می‌کنند، افزایش می‌یابد (رنجبر، 1384؛ فروتن و وادیدار، 1385).
بافت کالوس در شرایط درون شیشه‌ای معمولا سفید یا زرد و گاهی اوقات به رنگ سبز روشن میباشد. رنگدانه قهوه‌ای تیره اغلب به خاطر پیری سلول‌های کالوس بروز میکند و مربوط به تجمع فنل در آنها است. معمولا بافت کالوس حالت بی‌شکل دارد و نمی‌تواند ساختار آناتومیکی مشخصی داشته باشد، ولی بسته به منشا پیدایش و شرایط کشت ممکن است از نظر استحکام، ساختارهای متفاوتی بهخود بگیرد (سلمر و همکاران، 1996).
شرط ضروری تمایززدایی سلول‌های گیاهی و تبدیل آنها به بافت کالوس، وجود دو گروه از هورمون‌های گیاهی در محیط‌کشت‌ها شامل اکسین‌ها و سیتوکینین‌ها میباشد. اکسین‌ها موجب تمایززدایی سلولها می‌گردند و آنها را برای تقسیم آماده می‌کنند، در حالی که سیتوکنین‌ها باعث تکثير سلول‌های تمایززدایی شده می‌گردند (قاسمی بزدی و احمدی، 1388).
1-3-2 توليد متابوليتهاي ثانويه
متابوليتهاي ثانويه، مواد آلي شيميايي پيچيدهاي هستند كه گياهان در طول حيات خود توليد مينمايند، ولي در رشد و نمو و فعاليتهاي حياتي آنها نقشي ندارند و عمدتأ بهمنظور دفع آفات، جذب حشرات گردهافشان و مبارزه با بيماريهاي ميكروبي در گياه توليد ميشوند. مواد معطر، مواد مؤثره دارويي، چاشنيها، شيرين كنندههاي طبيعي، مواد ضد ميكروبي، فرمونها، حشرهكشها، علفكشها، قارچكشها، هورمونهاي گياهي و مواد آللوپاتيك از اين جمله ميباشند .براساس برخي از تخمينها حداقل صد هزار متابوليت ثانويه از 50000 گونه گياهي شناسايي شده است و هر سال 4000 متابوليت جديد از واريتههاي مختلف گياهي كشف ميشود (كومار و گوپتا، 2008).
اگرچه تقاضا براي اين تركيبات افزايش يافته است، اما برخي از اين گياهان، زيستگاههاي طبيعي محدود دارند و بسته به شرايط محيطي و جغرافيايي محل رويش گياه، جمعآوري آنها با مشكلاتي مواجه است. غلظت پايين اين تركيبات در گياه، محدوديت منابع طبيعي، تخريب روزافزون جنگلها، مراتع و فضاي سبز، نابودي گونههاي متنوع گياهي و جانوري، مشكلات مرتبط با اهلي نمودن و كشت زراعي اين گياهان، توجه محققين را به استفاده از راهكارهاي فناوري زيستي جهت افزايش توليد و بهرهوري گياهان دارويي معطوف نموده است. فناوري زيستي با بهرهگيري از علوم مختلف مانند بيولوژي، بيوشيمي، ژنتيك، غیره و با استفاده از راهكارهاي كشت سلولها، اندامها و بافتها، مهندسي ژنتيك و نشانگرهاي مولكولي قادر است كارآيي گياهان را بهعنوان منابع تجديدپذير جهت توليد دارو افزايش دهد (كومار و گوپتا، 2008؛ مولوباژال و تساي، 2004).
1-3-3 باززایی گیاه
باززایی گیاه از طریق پروتوپلاست، سلول‌های منفرد و ریزنمونههای گیاهی، بهدلیل وجود خاصیت توتیپوتنسی است. امروزه باززایی گیاه از طریق روش‌های کشت‌بافت، اساس روش‌های فناوری زیستی و اصلاح گیاهی قرار گرفته است بهطوری که از آن برای تکثیر غیرجنسی بسیاری از گیاهان زراعی و باغی در مقیاس تجاری استفاده میشود. یکی از مصادیق بارز خاصیت توتیپوتنسی، توانایی منحصر بهفرد گیاهان برای تولید جنین‌های سالم از سلول‌های منفرد بافت‌های سوماتیکی یا کالوس است. بهاین فرآیند جنین‌زایی سوماتیکی گفته میشود بهطوری که جنین‌های حاصل از آن می‌توانند در شرایط درون‌شیشه‌ای باززا شده و گیاه کامل جدیدی را ایجاد نمایند (رنجبر، 1384؛ فروتن و وادیدار، 1385).
1-4 کشت بافت گیاهان دارویی
روشهاي سنتي تكثير گياهان دارويي همانند ساير گياهان شامل روشهاي جنسي (تكثير با بذر) و غيرجنسي نظير: قلمه، خوابانيدن، پاجوش و غيره ميباشد. گياهان تكثير شده با بذر عمدتا از لحاظ ژنتيكي يكنواخت نيستند و گياه حاصله داراي تمام خواص گياه مادري نيست .بههمين جهت تكثير غيرجنسي به جنسي ترجيح داده ميشود .روشهاي سنتي تكثير غيرجنسي عمدتا با مشكلات متعددي از جمله محدوديت گياه مادري و بازدهي پايين مواجه است. كشت بافت، نوعي تكثير غيرجنسي در محيط درون شیشه‌ای است. مزيت تكثير از طريق كشت بافت نسبت به ساير روشهاي مرسوم، توليد تعداد زيادي گياه با محتواي ژنتيكي يكسان و كيفيت يكنواخت، در زمان كوتاهتر و فضاي نسبتا محدود ميباشد (تريپاتي و تريپاتي، 2003).
فناوري زيستي با استفاده از راهكارهايي نظير كشت سلول ها، اندام ها و بافت ها، مهندسي ژنتيك و كاربرد نشانگرهاي مولكولي قادر است كارآيي و بهرهوري گياهان دارويي را بهعنوان منابع تجديدپذير جهت توليد دارو افزايش دهد. كشت سلول، بافتها و اندامهاي گياهي امكان تكثير درون شیشه‌ای سريع و انبوه بسياري از گياهان دارويي مهم را فراهم نموده است. گياهان تكثير شده از طريق كشت‌هاي عاري از بيماري و از لحاظ ژنتيكي و كيفي يكنواخت ميباشند. نگهداري كشت سلول يا بافت گياهي به روش انجماد در نيتروژن مايع، يك روش مناسب جهت حفظ گياهان دارويي در معرض انقراض ميباشد. طي سالهاي اخير كشت سوسپانسيون سلولي و اندام (ساقه و ريشه مويين) جهت توليد متابوليتهاي ثانويه و مطالعه مسير بيوسنتز متابوليت‌ها مورد توجه قرار گرفته است. تاكنون كشت سلولي طيف وسيعي از گياهان دارويي بررسي شده است و تركيبات مهمي نظير: فلاونوئيدها، تانن‌ها، آلكالوئيدها و ترپنوئيدها از اين طريق توليد شدهاند. تركيبات محيط كشت، ريزنمونه، شرايط فيزيكي، افزودن پيش سازها، استفاده از القاگرهاي زنده و غيرزنده، افزايش نفوذ پذيري سلول، دور كردن محصول از محل توليد، بي‌تحرك نمودن سلول‌هاي گياهي و انتخاب سلول‌هاي با كارآيي بالا، از مهمترين فاكتورهاي موثر در افزايش توليد متابوليت ثانويه در كشت سلولي ميباشند(اميدي و فرزين، 1388).
كشت سلول، بافتها و اندامهاي گياهي امكان تكثير انبوه و سريع گياهان و توليد متابوليتهاي ثانويه را در شرايط درون شیشه‌ای فراهم ميسازد .با استفاده از كشت درون شیشه‌ای گياه، علاوه بر دسترسي به منبع اوليه دارو در شرايط كنترل شده و مستقل از محيط، افزايش توليد تركيبات نسبت به گياه و توليد تركيبات جديد نيز امكانپذير ميگردد (بروگاود و همكاران، 2002).
عليرغم هزينه لازم جهت پيشبرد روشهاي بيوتكنولوژي توليد تركيبهاي معطر چندين عامل وجود دارد كه مشوق اين ايده است. مصرفكنندههاي طبيعتگرا از از عوارض جانبي احتمالي افزودنيهاي مصنوعي غذا، نگران ميباشند. بنابراين فرآوردههاي طبيعي بهطور روزافزوني ترجيح داده ميشود. بهعلاوه تركيبهاي معطر حاوي از سيستمهاي كشت بافت گياهي، تخمير ميكروبي و يا تبديلات زيستي بايد نسبت بهنوع سنتزي آنها طبيعيتر باشند. همچنين مصرفكنندهها در رابطه با باقيماندههاي حشرهكشها و علفكشها كه معمولا در محصولات غذايي كشاورزي وجود دارد، نگران ميباشند. اين در حالي است كه توليد اين تركيبات بهروش كشت بافت گياهي نيازي به اين مواد ندارند. البته تنها پذيرش مصرفكننده در سوق دادن صنايع در جهت يافتن روشهاي بيوتكنولوژي بهمنظور توليد تركيبات معطر تعيينكننده نيست. محركهاي ديگري مانند فراهم شدن نامنظم مواد خام به واسطه شرايط نامناسب آب و هوايي، تغييرات فصلي يا محصولي، بلاياي طبيعي يا بيثباتي سياسي در مناطق رويش گياه نيز در اين كار دخيل ميباشند (هارلندر، 1994).
1-5 اهمیت تكثير بهليمو از طريق كشتبافت
تكثير گياه بهليمو با استفاده از كشت بافت راهحل كارآمد و مفيد براي غلبه بر مشكلات تكثير آن ميباشد. با استفاده از كشت درون شيشهاي ميتوان نسبت به توليد انبوه و عاري از آلودگي گياه بهليمو اقدام نمود. همچنين اولين گام در اصلاح ژنتيكي با استفاده از روشهاي ملكولي، توليد متابوليتهاي ثانويه در بيوراكتورها و افزايش ميزان ماده مؤثره به وسيله تكنيكهاي بيوتكنولوژيكي بهينهسازي كشتبافت اين گياه ميباشد. باتوجه به اهميت گياه بهليمو در صنايع مختلف بهينهسازي كشتبافت آن بهعنوان گام نخست در بهبود و افزايش توليد متابوليت ثانويه اين گياه حائز اهميت ميباشد (اولادزاد، 1391).
با توجه به اهميت اين گياه در صنايع داروسازي، پزشكي، آرايشي و بهداشتي و از آنجا كه نوع تكثير بهليمو اهميت بالايي در اين گياه دارد، پژوهش حاضر در قالب آزمايش‌هاي جداگانه مزرعه‌اي و كشت درون شيشهاي با توجه به اهداف زير اجرا گرديد.
1-6 اهداف تحقیق
1- بررسي اثر تركيبات هورموني محيط كشت در باززايي ريزنمونههاي بهليمو و تعيين بهترين تركيب محيط كشت.
2- بررسي اثر مواد مختلف موجود در محيط كشت بر ميزان اسانس بهليمو در شرايط درون شيشهاي
3- بررسي اثر تيمارهاي مختلف كودي بر روي عملكرد و خصوصيات مورفولوژيكي بهليمو در شرايط مزرعه.
4- بررسي اثر تيمارهاي مختلف كودي بر ميزان اسانس گياه بهليمو.
5- بررسی و مقایسه مقدار اسانس بهليمو در شرايط مزرعه و کشت بافت.
فصل دوم
مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1 گياهان دارويي
وجود 11 اقليم از 13 اقليم شناخته شده جهان، برخورداري از 300 روز آفتابي در سال و اختلاف دماي 40 تا 50 درجه سانتيگرادي ميان سردترين و گرمترين نقطه در كشور، شرايط مساعدي براي كشور پهناور ايران به‌لحاظ بهره‌مندي از يك شرايط اكولوژي منحصربه‌فرد فراهم كرده است؛ اين شرايط زمينه رشد و نمو گياهان وحشي و دارويي را در كشور مساعد كرده است. استفاده از گياهان دارويي در قالب طب سنتي براي درمان بيماري‌ها و مصارف ديگر در صنايع غذايي و بهداشتي از ديرباز مورد توجه بوده است، ولي در چند ساله اخير با گرايش مردم به استفاده از داروهايي با منشأ گياهي بهدليل عوارض جانبي و سوء داروهاي شيميايي، توجه جهانيان به اين بحث بيشتر شده است. از سوي ديگر، تأكيد سازمان بهداشت جهاني در جايگزيني تدريجي مواد طبيعي به‌جاي مواد شيميايي موجب شده تا كشورهاي مختلف جهان نسبت به سرمايه گذاري، برنامه‌ريزي كشت و توليد انبوه گياهان دارويي در سطوح صنعتي و استفاده از آن در صنايع دارويي، بهداشتي و غذايي اقدام كنند. چنين توجه و اقبالي به سوي گياهان دارويي، كشت و تجارت آن را در جايگاه اقتصادي مناسبي قرار داده است. بهطوري كه برآوردها حاكي از ده‌ها ميليارد دلار گردش مالي حاصل از پرداختن به اين تجارت است. اما با توجه به قابليت‌هاي كشورمان كه ذكر آن به ميان رفت و نظر به پيشينه كهن استفاده از گياهان دارويي در ايران، چنين بهنظر ميرسد كه هنوز از ظرفيت‌هاي موجود در كشور به خوبي بهرهبرداري نشده است و جايگاه مناسبي در عرصه تجارت جهاني گياهان دارويي وجود ندارد. سرمايه در گردش بازار جهاني گياهان دارويي حدود 123 ميليارد دلار اعلام شده است. توجه به اين رقم و مقايسه آن با رقم كل تبادلات جهاني فرش كه سالانه حدود 5 ميليارد دلار است، ميتواند ما را به اهميت سرمايه‌گذاري در توسعه كشت گياهان دارويي رهنمون كند (افشار، 1385).
فناوري زيستي قادر است كارآيي گياهان دارويي را جهت توليد دارو افزايش دهد. كشت سلول، بافتها و اندامهاي گياهي امكان توليد سريع و انبوه ژنوتيپ‌هاي مطلوب با محتواي ژنتيكي يكسان و كيفيت يكنواخت، در زمان كوتاهتر و فضاي محدود فراهم ميسازد. امروزه تعداد زيادي از گياهان دارويي از طريق ريزازديادي قابل تكثير ميباشند. اگرچه توليد متابوليتهاي ثانويه از طريق كشت سوسپانسيون سلولي و اندام در طيف وسيعي از گياهان دارويي بررسي شده است، ولي در حال حاضر اين روش فقط براي تركيبات باارزش افزوده بالا نظير داروهاي ضدسرطان (تاكسول، وين كريستين و وي نبلاستين) بهصورت صنعتي كاربرد دارد. شناسايي و دستكاري ژنتيكي آنزيم‌هاي دخيل در مسير متابوليكي بيوسنتز متابوليتهاي ثانويه و تراريزش ژنتيكي جهت افزايش مقدار متابوليتهاي ثانويه و توليد متابوليتهاي جديد ميتواند زمينه را براي كاربرد كشت سلولي در ساير گياهان نيز فراهم نمايد (اميدي و فرزين، 1388)
فاكتورهاي متعددي نظير شرايط اقليمي و ژنتيكي بر محتواي تركيبات دارويي گياه و كيفيت نهايي دارو موثرند. در سالهاي اخير مطالعات زيادي بهمنظور تعيين رابطه بين نشانگرهاي مولكولي و تنوعات كمي و كيفي تركيبات فعال دارويي در بين گونه‌ها و خويشاوندان نزديك گياهان دارويي صورت گرفته است. نشانگرهاي مولكولي بهدليل عدم وابستگي به سن، شرايط فيزيولوژيكي و محيطي گياه دارويي ابزاري قدرتمند در استفاده كارا از گونههاي مؤثر دارويي محسوب ميشوند. به كارگيري توأم روشهاي مولكولي و آناليز شيميايي HPLC و TLCميتواند اطلاعات مربوط به يك گونه دارويي خاص و همچنين كنترل كيفي و كمي تركيب دارويي مورد نظر را در سطح صنعتي افزايش دهد (اميدي و فرزين، 1388)
اسانس استحصالی از بذرهاي بهلیمو داراي بوي بسیار تند و رنگ نارنجی پررنگ و تیره (متمایل قرمز) است. میزان اسانس حاصل از بذور 31/0 درصد (وزنی/ وزنی) بود. نتایج تجزيه دستگاهی اسانس نشان داد که در بین ترکیبات شناسایی شده در اسانس، 12 ماده 12/80 درصد كل تركيبات را شامل شدند. همچنین بیشترین مقدار اجزاي این اسانس را ترکیبات ترپنوئیدي (شامل مونو و سزکویی ترپنوئیدها) تشکیل دادند (شاهحسيني و همكاران، 1390).
