عضو شوید
عضویت سریع
تبادل لینک هوشمند 
آمار مطالب
آمار بازدید
3-4- روش کار…………………………………………………………………………………………………………………………….36
3-5-طراحی آزمایشات…………………………………………………………………………………………………………………..37
3-5-1- طراحی مرکزی ترکیبی(CCD)…………………………………………………………………………………………….39
3-5-2- محاسبه تعداد آزمایشات لازم……………………………………………………………………………………………..40
3-5-3- مدل های تجربی……………………………………………………………………………………………………………….41
3-5-3-1- قدرت پیشگویی مدل……………………………………………………………………………………………………..42
3-5-3-2- آنالیز مدل با استفاده از جدول ANOVA…………………………………………………………………………..44
3-5-3-3- بدست آوردن نقاط بهینه متغیرها……………………………………………………………………………………….47
فصل چهارم: بحث ونتیجه گیری
4-1- بررسی تجربی آزمایشات………………………………………………………………………………………………………..53
4-1-1- بررسی تاثیر پارامترهای مختلف بر استخراج لیکوپن در اولتراسونیک…………………………………………53
4-1-1-1- بررسی تاثیر PH بر میزان استخراج…………………………………………………………………………………..54
4-1-1-2- بررسی تاثیر غلظت نمونه بر میزان استخراج……………………………………………………………………….56
4-1-1-3- بررسی تاثیرتوان و زمان های مختلف بر میزان استخراج……………………………………………………….58
4-1-1-3-1- بررسی توان 30درصد…………………………………………………………………………………………………58
4-1-1-3-2-بررسی توان 50درصد………………………………………………………………………………………………….59
4-1-1-3-3- بررسی توان 70درصد…………………………………………………………………………………………………60
4-1-1-3-4- بررسی توان 90درصد…………………………………………………………………………………………………61
4-1-2- بررسی تاثیر پارامترهای مختلف بر استخراج لیکوپن با استفاده از آنزیم……………………………………….62
4-1-2-1- بررسی تاثیر فعالیت های مختلف آنزیم سلولاز……………………………………………………………………63
4-1-2-2- بررسی تاثیر غلظت های مختلف نمونه در آنزیم سلولاز……………………………………………………….64
4-1-2-3- بررسی تاثیر زمان در استخراج آنزیمی………………………………………………………………………………65
4-1-3- بررسی تاثیر ادغام روش اولتراسونیک-آنزیمی در استخراج لیکوپن……………………………………………66
4-1-3-1- بررسی تاثیر زمان در روش اولتراسونیک-آنزیمی………………………………………………………………..66
4-2- ارزیابی داده ها با استفاده از طراحی آزمایشات و نرم افزارMODDE……………………………………………67
4-2-1- سلولاز……………………………………………………………………………………………………………………………..67
4-2-1-1- شرح آنالیز رگرسیون………………………………………………………………………………………………………68
4-2-1-2- تاثیر تغییر زمان اولتراسونیک و مقدار نمونه بر درصد بازدهی لیکوپن استخراجی………………………73
4-2-1-3- تاثیر تغییر فعالیت آنزیم و مقدار نمونه بر بازدهی استخراج لیکوپن…………………………………………74
4-2-1-4- تاثیر تغییر زمان اولتراسونیک و فعالیت آنزیم بر بازدهی استخراج لیکوپن………………………………..75
4-1-2-5- تاثیر سه پارامتر موثربر بازدهی استخراج لیکوپن………………………………………………………………….77
فصل پنجم: نتیجه گیری
5-3- نتیجه گیری نهایی…………………………………………………………………………………………………………………..80
5-3-1- برسی تجربی تاثیر پارامترهای مختلف روی بازدهی لیکوپن………………………………………………………80
5-3-1-1- تاثیر pH……………………………………………………………………………………………………………………..80
5-3-1-2- تاثیر زمان……………………………………………………………………………………………………………………..80
5-3-1-3- غلظت نمونه…………………………………………………………………………………………………………………81
5-4- پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………82
منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………83
فهرست اشکال
شکل1-1- مسیر سنتز کاروتنوئیدها……………………………………………………………………………………………………..3
شکل1-2- ساختار شیمیایی لیکوپن…………………………………………………………………………………………………….4
شکل1-3- ساختار کاروتنوئیدها…………………………………………………………………………………………………………6
شکل1-4- شماتیک دستگاه سوکسله…………………………………………………………………………………………………10
شکل1-5- شماتیک دستگاه سوکستک……………………………………………………………………………………………….12
شکل1-6- شماتیک دستگاه PLE ……………………………………………………………………………………………………16
شکل1-7- شمایی از نمودار فازی یک جسم خالص…………………………………………………………………………….17
شکل1-8- رفتار گرانروی دی اکسید کربن در دماها و فشارهای مختلف…………………………………………………20
شکل3-1- طراحی 3 فاکتوری روش CCF (سمت چپ) و روش CCC ( سمت راست )………………………….40
شکل3-2- شکل حداقل دار پاسخ سطحی (سمت چپ) و Contour plot مربوطه (سمت راست)…………48
شکل3-3- شکل حداقل دار پاسخ سطحی (سمت چپ) و Contour plot مربوطه (سمت راست)…………48
شکل3-4- شکل صعودی پاسخ سطحی (سمت چپ) و Contour plot مربوطه (سمت راست)…………….49
شکل4-1-استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک در pH=4.70 (توان 90 درصد)…………………………..53
شکل4-2- استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک در pH=5.50 (توان 90 درصد)…………………………..54
شکل4-3- استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک در pH=3.50 (توان 90درصد)……………………………55
شکل 4-4 بازدهی استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک (1گرم نمونه، pH=4.70)…………………………56
شکل 4-5- بازدهی استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک (نمونه 2گرمی، pH=4.70)…………………….57
شکل4-6 بازدهی استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک (نمونه 3گرمی، pH=4.70)………………………..58
شکل 4-7 بازدهی استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک (1گرم نمونه، pH=4.70، توان 30درصد)……59
شکل 4-8 بازدهی استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک (1گرم نمونه، pH=4.70، توان 50درصد)……60
شکل 4-9 بازدهی استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک (1گرم نمونه، pH=4.70، توان 70درصد)……61
شکل 4-10 بازدهی استخراج لیکوپن با استفاده از اولتراسونیک (1گرم نمونه، pH=4.70، توان 90درصد)….62
شکل4 -11 تاثیر زمان واکنش بر بازدهی استخراج لیکوپن……………………………………………………………………63
شکل 4-12 بررسی تاثیر واحد فعالیت های مختلف آنزیم سلولاز دراستخراج لیکوپن………………………………..64
شکل 4-13 بررسی تاثیر واحد غلظت های مختلف نمونه در فعالیت 40 واحد فعالیت آنزیم سلولاز دراستخراج لیکوپن ………………………………………………………………………………………………………………………………65
شکل 4-14 بازدهی استخراج لیکوپن در3 زمان مختلف در فعالیت 50 واحد فعالیت آنزیم سلولاز……………….66
شکل4-15 بررسی تاثیر زمان 20، 30 و40 دقیقه با استفاده از روش اولتراسونیک-آنزیمی …………………………67
شکل4-16. نمودار میزان تطابق داده های آزمایشگاهی و داده های پیش بینی شده با نرم افزار…………………….72
شکل4-17نمودار سه بعدی تاثیر زمان اولتراسونیک و مقدار نمونه بر درصد بازدهی استخراج لیکوپن………….73
شکل4-18نمودار سه بعدی تاثیر محتوی فعالیت آنزیم و مقدار نمونه بر درصد بازدهی استخراج لیکوپن………74
شکل4-19نمودار سه بعدی تاثیر زمان اولتراسونیک ومحتوی فعالیت آنزیم بر درصد بازدهی استخراج لیکوپن……………………………………………………………………………………………………………………………………………………76
شکل4-20نمودار دو بعدی تاثیرمقدار نمونه ، زمان اولتراسونیک ومحتوی فعالیت آنزیم بر درصد بازدهی استخراج لیکوپن ………………………………………………………………………………………………………………………………..77
فهرست جداول
جدول 1-1- مقایسه قدرت آنتی اکسیدانی کاروتنوئیدها بر اساس توانایی جذب اکسیژن آزاد………………………5
جدول 1-2- تغییرات دانسیته دی اکسید کربن بر حسب فشار (بار) و دما (درجه سانتیگراد)……………………….18
جدول 1-3- مقایسه داده های فیزیکی برای گاز ها، سیالات فوق بحرانی و مایعات…………………………………..22
جدول 1-4- پارامترهای بحرانی برخی سیالات فوق بحرانی………………………………………………………………….25
جدول 3-1- تعداد آزمایشات لازم برای طراحی فشرده از 2 تا 5 فاکتور…………………………………………………41
جدول3-2- مقادیر کد شده متغیرهای مستقل در سطوح مختلف…………………………………………………………….50
جدول 4-1- داده های بدست آمده در آزمایشات برای آنزیم سلولاز………………………………………………………68
جدول 4-2- مقادیر ضریب رگرسیون و احتمال مربوطه………………………………………………………………………..69
جدول4-3- جدول تحلیل ANOVA، محاسبه شده توسط نرم افزار DESIGN-EXPERT………………….70
چکیده:
روش های متداول تجاری در استخراج عمتدتاٌ بر سه اصل استوار می باشد: فیزیکی، شیمیایی و ترکیبی از این دو. مکانیسم اصلی عبارت است از شکستن ساختمان دیواره سلولی گیاهان. با توجه به فوائد بسیار زیاد لیکوپن به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی و یک ترکیب بالقوه با ارزش در سالهای اخیر توجه زیادی در استخراج آن معطوف شده است. تمایل برای کاهش استفاده از حلال های آلی خطرناک در استخراج روغن در سال های اخیر موجب توسعه روش های جدید استخراج با مصرف کم حلال نسبت به روش های کلاسیک شده است. در این میان روش های استخراج به کمک آنزیم ها و استخراج با سیال فوق بحرانی و استخراج با مایکروویو و استخراج با اولتراسونیک مورد استفاده قرار گرفته است و از محبوبیت خوبی برخوردار بوده است. دراین میان روش آنزیمی برای استخراج بیشتر مورد توجه است اما یکی از مشکلات این روش هزینه ی بالای این روش است اما راه های مختلفی برای بهینه سازی استخراج لیکوپن وجود دارد یکی از این راه ها استفاده از روش ترکیبی می باشد. در مطالعه حاضر از روش استخراج با کمک آنزیم- اولتراسونیک از ضایعات گوجه فرنگی استفاده شده است. برای این کار از آنزیم سلولاز ( Cellulase ) استفاده شده است. جهت تعیین شرایط بهینه جهت استخراج لیکوپن از ضایعات گوجه فرنگی تاثیر شرایطی همچون میزان pH ، زمان واکنش ، مقدار نمونه ، فعالیت آنزیم و توان های مختلف اولتراسونیک مورد بررسی قرار گرفتند و تاثیر هر کدام از این پارامترها را یکبار به صورت تجربی و بار دیگر با استفاده از انجام طراحی آزمایشات بوسیله نرم افزار Design-Expert بررسی شده است . میزان بازدهی بهینه استخراج 93 درصد در pH=4/70 و سرعت چرخش 200 دور در دقیقه با توان 50 و زمان اولتراسونیک 30 دقیقه بدست آمد.
کلید واژگان: دیواره سلولی، لیکوپن ، آنتی اکسیدان، اولتراسونیک.
فصل اول
مقدمه
1-1- مقدمه:
گوجه فرنگی یکی از مهمترین محصولات تولید باغی در جهان است که با یک تخمین جهانی تولید آن بیش از 120 میلیون تن برآورد شده است واز نظراقتصادی در مقام دوم جهان قرار دارد موطن اصلی گوجه فرنگی آمریکای جنوبی ومرکزی بود که تا سده 1800 اروپائیان آن را سمی می دانستند و تنها آن را به عنوان زینتی می کاشتند. اجداد گوجه فرنگی گیاهان علفی خودرویی بوده اند که این گیاهان گونه مختلفی از سرده پیشین Lycopersicon بودند. یکی از این گونه ها با نام علمی Solanum Lycopersium به مکزیک منتقل شد واز آنجا توسط بومیان پرورش یافت( 2،1، 3، 4). میزان تولیدگوجه فرنگی سالانه در ایران 8/5 میلیون تن و در جهان سالانه حدود 130ملیون تن است که طبق برآوردهای شورای جهانی فرآوری گوجه فرنگی(WPTC) حدود 3 الی5 درصد وزن کل گوجه فرنگی ضایعات آن است که برآورد شده است(9،5). شواهداپیدمولوژیکی نشان می دهد که مصرف محصولات گوجه فرنگی تازه و فرآوری شده باعث کاهش خطر ابتلا به انواع سرطان(6) و کاهش شیوع بیماری ایسمیک قلبی می شود(7). این اثرات مفید در درجه اول به فعالیت آنتی اکسیدانی گوجه فرنگی نسبت داده شده است.گوجه فرنگی حاوی طیف گسترده ایی از آنتی اکسیدانها شامل ویتامینE، اسید آسکوربیک، کارتنوئیدها، فلاونوئیدها و فنولیک ها است که در میان آن لیکوپن کاروتنوئید مسئول رنگ قرمز گوجه فرنگی رسیده است که در سالهای اخیر توجه زیاد به عنوان امکان جذب آن در پیشگیری از بیماریها شده است(10، 11، 12).
2-1- لیکوپن
1-2-1- تاریخچه لیکوپن:
لیکوپن یک آنتی اکسیدان قوی است که در مسیر سنتز کاروتنوئیدها ساخته میشود(13). ساختار لیکوپن در سال 1930 توسط کرر و همکارانش تعیین شد(14،15).
شکل۱-۱ مسیرسنتز کاروتنوئیدها
1-2-2- ساختار شیمیایی لیکوپن:
لیکوپن یک کاروتنوئید (C40H56) با 11پیوند مزدوج و2 پیوند غیر مزدوج با وزن مولکولی 85/536 دالتون وغالب در پلاسمای انسان است که این رنگدانه طبیعی توسط گیاهان و یا میکروارگانیسم ها سنتز می شود(17،16، 18). همچنین یک ترکیب لیپوفیلیک ونامحلول در آب است، از آنجا که لیکوپن فاقد حلقه P-ionone درساختار خود می باشد بنابراین فاقد فعالیت ویتامین A است(19).
شکل۱-۲ ساختار شیمیایی لیکوپن
لیکوپن در حالت طبیعی به طور طبیعی به شکل ایزومری ترانس می باشد ولی در اثر نور، حرارت، واکنش های شیمیایی وفرآوری های مختلف غذایی و جذب در بدن انسان وجانوران مختلف به اشکال ایزومری مختلف سیس تغییر پیدا می کند. متداول ترین فرم لیکوپن ایزومرهای ترانس، 5-سیس، 9-سیس، 13-سیس و 15-سیس است که دربین آنها ایزومر 5-سیس به علت کمترین انرژی پایدارتر است(20، 21،16،22،23).
لیکوپن مستعد تخریب اکسداتیو است( 25، 27، 24) بنابراین استخراج، ذخیره سازی، فرآوری، تجزیه وتحلیل از لیکوپن باید تحت شرایط محیطی کنترل شده انجام شود(25) حضور زنجیره طولانی پیوند دوگانه مزدوج کربن-کربن باعث می شو که به محض قرار گرفتن لیکوپن در معرض نور دچار تغییرات شیمیایی می گردد (23، 24).
1-2-3- نقش لیکوپن در سلامت انسان:
تخریب اکسیداسیون در حال حاضر به عنوان یک علل مهم در بیماری های مزمن از جمله سرطان، بیماری های قلبی و عروقی، پوکی استخوان و دیابت شناخته شده است. آنتی اکسیدان ها نقش مهمی را در کاهش اثرات مخرب اکسیداسیون در سلول را دارند(26). لیکوپن به دلیل تعداد بیشتر باندهای دوگانه مزدج خواص آنتی اکسیدانی بیشتری دارند و یکی از قویترین آنتی اکسیدانها است(28، 31، 33). لیکوپن به دلیل داشتن خواص آنتی اکسیدانی بیشتر نسبت به بتا کاروتن( جدول1) در درمان بسیاری از بیماری ها استفاده می شود( 29).
جدول ۱-۱ مقایسه قدرت آنتی اکسیدانی کاروتنوئیدها بر اساس توانایی جذب اکسیژن آزاد
نوع کاروتنوئید قدرت آنتی اکسیدانی
لیکوپن 31
گاماکاروتن 25
آستازانتین 24
کانتاگزانتین 21
آلفاکاروتن 19
بتاکاوتن 14
زیزانتین 10
لوتئین 9
1-2-3-1- ساختار کاروتنوئیدها:
شکل۱-۳ ساختار کاروتنوئید
1-2-3-2- سرطان پروستات:
سرطان پروستات یک بیماری است که به نظر می رسد در چند دهه اخیر گسترش یافته است از آنجایی که جز ضایعات پیش سرطانی هستند معمولا از دهه سوم زندگی در مردان مشاهده می شود. اولین بار جیووانسی وهمکاران(1995) گزارشی که نقش کاروتنوئیدها در کاهش سرطان پروستات را بیان می کرد منتشر کردند(30، 32). به تازگی جیووانسی مطالعاتی را در ارتباط با مصرف گوجه فرنگی، لیکوپن وخطر ابتلا به سرطان پروستات را مورد بررسی قرار داد طبق مطالعات اپیدمیولوژیکی از10 موردی را که ارزیابی کرد8 مورد از آنها کاهش خطر ابتلا مشاهده شد(38) . محتمل ترین مکانیسم را که می توان برای نقش لیکوپن در نظر گرفت نقش آن در خنثی کردن رادیکال های آزاد است(35).
1-2-3-3- بیماری های استخوانی:
اگر چه شیمی کاروتنوئیدها به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است، در حال حاضر جذب، متابولیسم و توابع بیولوژیکی بررسی شود. واکنش های مخرب اکسیداسیونی از مهمترین عوامل مهم در بیماری پوکی استخوان می باشد که آنتی اکسیدان های طبیعی نظیر لیکوپن می تواند نقش جلوگیری کنندگی را داشته باشد(34). لیکوپن موجب تحریک ساخت سلول های استخوانی شده واز ناهنجاری های شکلی و کجی استخوان جلوگیری می کند(37).
1-2-3-4- سایر بیماری ها:
خاصیت آنتی اکسیدانی لیکوپن توجه تحقیقات علمی را به نقش محافظتی آن در فشار خون بالا به خود جلب کرده است. مطالعه اخیر مصرف مکمل لیکوپن به مدت 8 هفته به میزان 15 میلی گرم در روز کاهش فشار خون مشاهده شد. کسانی که به صورت مداوم از لیکوپن استفاده می کنند 30تا 60 درصد کمتر به بیماری های گوارشی مبتلا می شوند( 34، 36). همچنین مطالعات اپیدمیولوژیکی در سال های اخیر نشان می دهد که مصرف گوجه فرنگی ومحصولات غذایی گوجه فرنگی خطر ابتلا به سرطان حفره دهان، حلق، مری، معده، روده بزرگ، مثانه را در انسان کاهش می دهد.این اثر محافظتی به خواص آنتی اکسیدانی و پروویتامینی ترکیبات مغذی در بدن است(50).
1-3- انواع روشهای استخراج:
هدف از استخراج، جدا کردن و بازیابی ترکیبات مورد نظر از بافت نمونه است که اکثراً شامل تغییر و انتقال از فاز جامد به فاز مایع می باشد. سادگی، سرعت عمل و بازیابی کمی ترکیبات مورد نظر از بافت نمونه، بدون کاهش و یا تجزیه شدن انها و اقتصادی بودن روش از خصوصیات یک روش خوب است(45). یکی از روش های معروف و مورد استفاده در صنایع و آزمایشگاه ها روش استخراج با حلال است که به کمک دستگاه سوکسله انجام می شود. این روش ها مستلزم مصرف حجم زیاذی از حلال های آلی خطرناک در استخراج های تجربی در سال های اخیر موجب توسعه روش های جدید استخراج با مصرف کم حلال نسبت به روش های کلاسیک شده است. در میان این روش ها، روش های استخراج به کمک آنزیم ها، استخراج با سیال فوق بحرانی ، استخراج با کمک مایکروویو و استخراج با مایع تحت فشار (41،40) از محبوبیت بسیار برخوردار است و در بسیاری از فرآیندهای زیست محیطی استفاده شده است(41،39). در این پروژه از ادغام روش استخراج فراصوت و آنزیمی برای استخراج لیکوپن از ضایعات گوجه فرنگی استفاده شده است. لذا لازم است به طور مختصر مفهوم استخراج و روش های مختلف آن معرفی شود.
تعریف استخراج:
انتقال یک ترکیب از مایع به مایع دیگر ویا از فاز جامد به مایع را استخراج می گویند. استخراج برچند نوع است:
1ـ استخراج مایع ـ مایع : که به استخراج از یک مایع به مایع غیر قابل امتزاج دیگر گفته می شود.
2ـ استخراج فاز جامد : که به استخراج از یک مایع توسط یک بستر جامد اطلاق می شود.
3ـ استخراج مایع ـ جامد :که به استخراج از جامد توسط مایع گفته می شود(45).
روش های عملی استخراج عبارتند از:
1 ـ سوکسله
2 ـ سوکستک
3 ـ استخراج با کمک مایکروویو
4 ـ استخراج با کمک امواج مافوق صوت
5 ـ استخراج با حلال تسریع شده یا استخراج با مایع تحت فشار
6 ـ استخراج با سیال فوق بحرانی
7 ـ استخراج به کمک آنزیم ها
1-3-1- روش سوکسله
روش سوکسله اولین بار در سال 1848 توسط یک شیمیدان آلمانی به نام فرنس ون ساکسله معرفی شد. این روش برای استخراج مایع ـ جامد استفاده می شود.شماتیک دستگاه سوکسله در شکل1 ـ1 ارائه شده است. هر سیستم شامل یک وسیله گرم کننده{1}، بالن حاوی حلال {2}، محفظه استخراج {3} که نمونه بعد از قرار گرفتن در کاغذ صافی که به صورت انگشتانه درآمده {4} در داخل محفظه استخراج جاگذاری می شود و مبرد {5} که حلال در آن سرد شده و به داخل محفظه استخراج برگردانده می شود. مقداری پشم شیشه یا گلوله شیشه ای روی نمونه قرار داده می شود تا بر اثر چکیدن حلال از مبرد به داخل نمونه کانال ایجاد نشود و یا از پخش شدن نمونه جلوگیری شود (49).
شکل۱ـ۴ شماتیک دستگاه سوکسله(49)
روند کار به این ترتیب است که نمونه وزن شده داخل انگشتانه ریخته می شود ودر محفظه استخراج جایگذاری می شود. حلال گرم می شود واز لوله جانبی دستگاه سوکسله بالا می رود. حلال بعد از سرد شدن در مبرد به داخل محفظه استخراج می چکد. هنگامی که سطح حلال در محفظه به نقطه {6} رسید حلال که حاوی مواد استخراج شده است به داخل بالن حلال تخلیه می شود. این سیکل چندین بار انجام می شود تا استخراج کامل شود. لذا همواره حلال تازه با نمونه در تماس است به این ترتیب بازده استخراج افزایش پیدا می کند. این روش به زمان طولانی و مقدار زیادی حلال نیاز دارد(49).
1-3-2- سوکستک
یک روش استخراج اصلاح شده است که مبنای آن روش سوکسله می باشد این روش در سال 1970 معرفی شد ودر سال 1982 تجاری سازی شده است(42) هر دستگاه سوکسله شامل اجزای زیر است:
{1}ظرف حاوی حلال
{2}انگشتانه که نمونه در آن قرار داده می شود.
{3}سیستم بازیابی حلال که مجهز به شیر است که در مرحله بازیابی حلال بسته می شود.
{4}مبرد
شکل۱ـ۵ شماتیک دستگاه سوکستک(42)
استخراج توسط دستگاه سوکستک شامل 3 مرحله است:
1ـ مرحله جوشیدن
2ـ مرحله شستشو
3ـ مرحله بازیابی حلال
که 3 مرحله در شکل 1ـ2 نشان داده شده است.
روند کار به این ترتیب است که نمونه وزن شده داخل انگشتانه ریخته می شود و به طور مستقیم در حلال در حال جوش قرار داده می شود. حلال تبخیر شده بعد از رسیدن به مبرد سرد شده و وارد محفظه بازیابی حلال می شود. در مرحله جوشش شیر متصل به لوله جانبی باز است و لذا حلال دوباره به ظرف حلال بر می گردد.
در مرحله شستشو انگشتانه حاوی نمونه از داخل محلول خارج و توسط حلال خارج شده از لوله جانبی شسته می شود. در مرحله بازیابی حلال شیر متصل به لوله جانبی بسته می شود و حلال در محفظه بازیابی جمع می شود و نمونه در ته ظرف تغلیظ می شود. روش استخراج با سوکستک نسبت به سوکسله روش سریعتری است و جداسازی حلال از نمونه سریعتر انجام می شود. همچنین مشخص شده که بازیابی و دقت این روش از سوکسله بیشتر می باشد.
1-3-3- استخراج به کمک مایکروویو (MAE):
به جهت کاهش زمان استخراج و میزان مصرف حلال روشهای جدید در سه دهه اخیر توسعه پیدا کرده اند. یکی از این روشها روش استخراج به کمک مایکروویو (MAE) است. در این روش از انرژی مایکروویو برای گرم کردن حلال که به طور مستقیم در تماس با نمونه است،استفاده می شود. مهمترین عامل در موفقیت این روش ها در کاهش زمان وکاهش مصرف حلال و کار در دمای بالاتر از نقطه جوش حلال است) 42،43( . از فرکانس های MHZ 300000 -300 استفاده می شود. در این روش وجود یک حلال با دو قطبی ذاتی ضروری است که در اثر میدان اعمال شده شروع به چرخش کند و انرژی لازم برای استخراج را تولید کند. در روش گرمایی هدایتی در اثر جریان همرفتی یک گرادیان گرمایی تولید می شود و فقط یک قسمت کوچک از مایع که در تماس با ظرف است، دارای دمای مورد نظر است یعنی حلال به طور یکنواخت گرم نمی شود ولی در روش مایکروویو همه نمونه به طور همزمان گرم می شود بدون اینکه ظرف گرم شود. لذا حلال سریعتر به نقطه جوش خود می رسد و از طرف دیگر چون فشار در داخل محفظه بالاست دمای جوش حلال از دمای جوش حلال در اتمسفر بیشتر خواهد شد. به همین دلیل است که بازده استخراج بالاست و زمان استخراج نیز کاهش می یابد(49).
1-3-4-استخراج با امواج فرا صوت:
در این روش امواج فرا صوتی به عنوان یک انرژی کمکی و شتاب دهنده برای استخراج استفاده می شود. این امواج به فرایندهایی مثل انحلال واختلاط سرعت می بخشند (42،48). به همین دلیل به عنوان روش سریع و موثر برای استخراج مواد معدنی و آلی استفاده می شود. از این روش برای استخراج ترکیبات PCB در خاک استفاده شده و نتایج قابل قبولی حاصل شده است (53،44) قریشی جداسازی ترکیب ذکر شده را از خاک های آلوده را با دی اکسید کربن فوق بحرانی (46) را بررسی کرده و نتایج بهتری را به دست آورده است. همچنین از این روش برای استخراج مواد فعال طبیعی مانند ویتامین E استفاده شد و نتایج قابل ملاحظه ای نسبت به روش سنتی سوکسله بدست آمد (52). در کار دیگر از این روش برای استخراج آلومینیوم در آب میوه ها و نوشیدنی های بدون الکل استفاده شد. بازیابی و دقت بالایی حاصل شد ضمن اینکه زمان استخراج نیز کاهش یافت (48).
1-3-5-استخراج با مایع تحت فشار :(PLE)
این روش، روشی جدید برای استخراج از ترکیبات جامد و نیمه جامد در فشار و دماهای بالاست. از این روش در برخی موارد تحت عنوان استخراج تسریع شده با حلال (ASE) نام برده می شود (51،47،54،41،39).
اولین گزارش از استفاده PLE در سال 1995 بود که برای اندازه گیری مواد زاید و آفت کش ها در خاک و در اندازه گیری ترکیبات آروماتیک چند هسته ای استفاده شد (55،58،42). قبل از آن یک گروه در آژانس حفاظت از محیط زیست (EPA) در آمریکا یک روش جدید برای استخراج از مواد جامد و نیمه جامد ارایه کرد. این روش تحت عنوان ASE در سال 1994 پذیرفته شد. بررسیهای بعدی موجب ایجاد یک روش جدید شده که امروزه برای استخراج دسته متنوعی از ترکیبات مورد استفاده قرار می گیرد(55). مزیت های نسبی این روش نسبت به روشهای سنتی استخراج عبارتند از :
ـ در کسری از زمان (در دقیقه) انجام می شود.
ـ هزینه پایین است و مصرف حلال تا 90./. کاهش می یابد.
ـ برای دسته زیادی از ترکیبات استفاده می شود.
ـ روشی خودکار بوده و می تواند به طور همزمان تعداد زیادی استخراج را انجام دهد(61،51،59،55).
در این روش از حلالهای معمولی که در استخراج های سنتی به کار می رود، استفاده می شود. نمونه در داخل سل های از جنس استیل با تحمل فشارهای بالا قرار داده می شود. حلال تحت فشار با دمای بالا وارد سل می شود. مدت زمانی ثابت در تماس با نمونه قرار داده می شود واستخراج به صورت استاتیک انجام می شود . سپس نمونه استخراج شده با جریانی از حلال از داخل سل استخراج در ظرف نمونه برداری جمع آوری می شود (56 ،59 ،55 ،42) که این مرحله را استخراج پیوسته می نامند.
روش PLE یک روش کاملا خودکار است و در کسری از زمان (در چند دقیقه) انجام می شود و میزان مصرف حلال آن پایین است(47). موثر بودن این روش بر مبنای افزایش حلالیت در دمای بالاتر قرار دارد (61،62). در دماهای بالاتر سرعت واجذب مواد از داخل بافت نمونه نسبت به استخراج در دمای محیط شتاب پیدا می کند. لذا میزان مصرف حلال کاهش می یابد که این نتیجه ای از افزایش حلالیت براثر افزایش دما است. فشار بالا موجب افزایش نقطه ی جوش حلال شده و در حالت مایع نگه داشته می شود. به عبارت دیگر فرایند های سرعتی برای خارج شدن آنالیت از بافت نمونه شتاب داده می شود(62،51،56).
شماتیک دستگاه PLE را در شکل1ـ3 ارایه شده است. (62):
شکل۱ـ۶ شماتیک دستگاه PLE
هر سیستم PLE شامل مخزن حلال {1}، پمپ برای ایجاد فشار و پمپ کردن حلال، گرمخانه جهت رساندن دمای حلال به دمای مورد نظر {3} سل حاوی نمونه {4} و ظرف مخصوص جمع آوری نمونه {5} است. در این روش استخراج شامل مراحل زیر می باشد:
1ـ پر کردن نمونه در داخل سل وقرار دادن در داخل گرمخانه.
2ـ پر کردن سل به وسیله حلال.
3ـ گرم کردن و رساندن فشار به فشار مورد نظر.
4ـ استخراج به صورت استاتیک.
5ـ استخراج به صورت دینامیک.
6ـ جمع آوری نمونه(51،54،39).
1-3-6- استخراج با سیال فوق بحرانی
سیال فوق بحرانی ماده ای است که دما و فشار آن به ترتیب بالاتر از دما و فشار بحرانی باشد. خواص این سیال شبیه به گازها می باشد ومایعات است، زیرا سیال قابل تراکمی بوده و ظرف خود را پر می کنداز این جهت همانند گازها می باشدو از لحاظ دانسیته (1/. تا1 گرم بر سانتی متر مکعب) و قابلیت انحلال ترکیبات در آن، قابل مقایسه وشبیه به مایعات بوده و بر هم کنش هایی نظیر مایعات از خود نشان می دهد(61).
شکل 1ـ4 دیا گرام فازی یک ماده خالص را نشان می دهد(57).اگر بر روی محور تعادل گاز و مایع به طرف نقطه بحرانی حرکت کنیم، با افزایش درجه حرارت به دلیل انبساط گرمایی دانسیته مایع کمتر شده، در حالیکه به دلیل افزایش فشار دانسیته گاز بیشتر می شود. در بالاتر از نقطه بحرانی، دانسیته هر دو فاز یکسان شده و تفاوت بین مایع و گاز از بین می رود و ماده به سیال فوق بحرانی تبدیل می شود. نقطه بحرانی با مختصات دمای بحرانی(Tc) وفشار بحرانی(Pc) مشخص می گردد. در بالای نقطه بحرانی ماده سیال فوق بحرانی نامیده می شود. ناحیه ای که استخراج فوق بحرانی نامیده می شود، در بالای نقطه بحرانی قرار دارد و دانسیته، حلالیت ودیگر خواص آن ما بین گازها و مایعات است.
شکل ۱ـ۷ شمایی از نمودار فازی یک جسم خالص
1ـ3ـ6ـ1 خواص فیزیکی سیالات فوق بحرانی:
سیالات فوق بحرانی سیالاتی هستند که دماها و فشارهای کاهش یافته ی آن ها از واحد بیشتر است، که در این حالت قدرت حلالیت سیال بیشتر می شود. در زیر خواص فیزیکی مهم سیالات فوق بحرانی بیان می شود که عبارتند از:
1ـ دانسیته 2ـ ویسکوزیته 3ـ ضریب نفوذ 4ـ حلالیت
1ـ3ـ6ـ1ـ1ـ دانسیته
سیال فوق بحرانی دانسیته ای قابل مقایسه با دانسیته مایع دارد که ظرف بالایی برای انحلال ماده حل شونده ایجاد می کند. برای یک ماده در دمای بالای دمای بحرانی، می توانیم به دانسیته ای تا حد نزدیک به دانسیته ی مایع با افزایش در فشار برسیم(یعنی تقریبا (2ـ 7./) برابر فشار بحرانی).
غالبا در دمای ثابت، با افزایش فشار، دانسیته افزایش می یابد و در نتیجه قدرت حلالیت نیز زیاد می شود، در حالی که افزایش دما در فشار ثابت، باعث کاهش دانسیته و در نتیجه کاهش قدرت حلالیت می گردد. بنا براین دما، فشار و دانسیته مهمترین پارامترهای کنترل کننده ی فرایند استخراج می باشند(63).
در جدول1ـ1 تغییرات دانسیته سیال دی اکسید کربن(g/mL) بر حسب فشار (بار) و دما (درجه سانتیگراد) آورده شده است(63).
جدول ۱ـ۲ تغییرات دانسیته دی اکسید کربن بر حسب فشار (بار) ودما (درجه سانتیگراد)
چگالی 40 50 60 70 80 90 100 110 120
00/1
95/0
90/0
85/0
80/0
75/0
70/0
65/0
60/0
55/0
50/0
45/0
40/0
35/0
30/0
25/0
20/0 526
383
281
211
164
134
115
104
97
93
91
89
87
84
81
77
70 618
463
350
269
213
175
150
133
122
115
109
104
100
96
90
84
75 544
420
329
264
218
187
165
149
138
129
122
115
108
101
93
82 644
489
401
314
261
223
196
176
161
148
138
129
120
111
100
88 680
518
447
365
305
260
227
203
183
168
155
143
132
121
108
94 416
348
297
259
229
206
188
172
157
144
130
116
99 467
392
334
290
256
230
207
188
171
155
140
123
105 436
372
322
284
252
227
205
185
167
149
130
110 510
425
354
311
276
246
221
197
178
158
137
116
بنابراین برای یک فشار خاص، قدرت انحلال حلال در دماهای پایین تر ، نزدیک به دمای بحرانی، باید بیشتر باشد و در یک دمای خاص، قدرت انحلال حلال فوق بحرانی در فشارهای بالاتر بیشتر است. دانسیته در فشارهای نزدیک بحرانی به دما حساسیت بیشتری دارد تا فشارهای بالاتر. اگر تراکم حلال فوق بحرانی در شرایط دمای ثابت کاهش می یابد و تا حدود5/0 Pr=منبسط شود قدرت انحلال گاز افت پیدا می کند و ماده حل شونده به عنوان فاز جدا، ته نشین می شود(60).
1ـ3ـ6ـ1ـ2ـ گرانروی (ویسکوزیته)
همانند دانسیته، مقادیر برای گرانروی نیز به دما وفشار وابسته است. گرانروی سیال فوق بحرانی با افزایش فشار به شرایط مایع، نزدیک می شود. در مقابل افزایش دما که منجر به افزایش گرانروی گاز می شود درمورد سیالات فوق بحرانی، با افزایش دما کاهش می یابد. شکل 1ـ5 رفتار گرانروی دی اکسید کربن را بر اساس دما وفشار نشان می دهد. کرانروی سیالات فوق بحرانی تقریباً 3ـ10ـ4ـ10 پویز است که بین گرانروی گاز و مایع می باشد. چون گرانروی پایین است سرعت رسوب گذاری در سیالات فوق بحرانی بالا است و ماده حل شده به راحتی از محلول جدا می شود(63). برای مواد مختلف روابط ریاضی متفاوتی ارائه شده است. خواص مورد نیاز برای محاسبه گرانروی با این روابط عبارتند از:
وزن مولکولی، ثابت های بحرانی و دانسیته مایع در دما و فشارهای مورد نظر. برای گازهای غیر طبیعی همانند دی اکسید کربن روابط 3ـ1 تا 3ـ5 به کار برده می شود(70).
شکل ۱ـ۸ رفتار گرانروی دی اکسید کربن در دماها وفشارهای مختلف(70)
(۱ـ۱)
(۱ـ۲)
(۱-۳) QUOTE
(۱ـ۴)
(۱ـ۵)
(واحد ویسکوزیته در این روابط سنتی پویز (CP) می باشد.)
1-3-6-1-3- ضریب نفوذ
ضریب نفوذ را می توان به عنوان معیار انتقال جرم در نظر گرفت و می دانیم مکانیسم های سرعت انتقال جرم نقش مهمی در طراحی وبزرگنمایی وسایل استخراج دارند. برای نشان دادن نقش نفوذ در ذرات حفره دار در پارامترهای طراحی، زمان نفوذ را به صورت QUOTE در نظر می گیریم. در این رابطه D12 ضزیب نفوذ مولکولی، تخلخل دانه کروی، ضریب پیچیدگی وR مشخصه طولی می باشد که معمولاً با شعاع ذره بیان می شود.
معمولاً مقادیر ضریب پیچیدگی در محدوده 2ـ20 قرار گرفته اند وتخلخل هم به طور معمول در دامنه 4/0ـ5/0می باشد. با در نظر گرفتن ضریب پیچیدگی 10 و تخلخل 4/0با توجه به اینکه ضریب نفوذ فوق بحرانی از مرتبهcm2/s 4ـ10می باشد، می توانیم زمان نفوذ را تخمین بزنیم. برای ذره کوچکی به شعاع 1 میلیمتر، زمان نفوذ حدود2500 ثانیه می شود. بنابراین هر چه ضریب نفوذ بالاتر باشد زمان عملیات کمتر و راندمان بالاتر خواهد بود. پس باید ارتباطی بین ضریب نفوذ و شرایط عملیاتی بدست آوریم تا بتوانیم با کنترل شرایط عملیاتی مقدار دلخواهی از ضریب نفوذ داشته باشیم. جدول 1ـ2 بعضی از پارامترهای مهم را برای حالت های گاز، سیال فوق بحرانی و مایع مقایسه می کند.
جدول۱ـ۳ مقایسه داده های فیزیکی برای گازها، سیالات فوق بحرانی و مایعات(47)
دانسیته
(g/ml) ویسکوزیته دینامیکی
(g/cm.sec) ضریب نفوذ
(cm2/sec)
گاز(شرایط محیط)
سیال فوق بحرانی(Tc,Tp)
مایع ( شرایط محیط) 0006/0ـ 002/0
5/0ـ 2/0
6/1ـ 6/0 300/0ـ 0001/0
0003/0ـ 000/0
03/0ـ 002/0 4/0ـ1/0
0007/0
00002/0ـ000002/0
مقادیر نفوذ ناپذیری یک سیال فوق بحرانی نیز وابسته به دما و فشار است. مقدار کم کشش سطحی( ضرورتاً صفر) سیالات فوق بحرانی، باعث نفوذ پذیری بهتر نسبت به حالت مایع می شود. از جدول و نمودارهای در دسترس در رابطه با سیالات فوق بحرانی این طور برمی آید که ضریب نفوذ مولکولی دی اکسید کربن فوق بحرانی با افزایش وزن مولکولی حل شونده، کاهش می یابد(58).
1ـ3ـ6ـ1ـ4ـ حلالیت
در بررسی حلالیت رقابت بین فشار بخار جزء حل شونده و دانسیته سیال فوق بحرانی می باشد.که فشار بخار جزءحل شونده تابعی از دما و دانسیته تابعی از دما و فشار است.
1ـ3ـ6ـ2ـ مقایسه ی دی اکسید کربن با سایر مواد به عنوان سیال فوق بحرانی
جدول 1ـ3 پارامتر های بحرانی برخی از ترکیبات مفید به عنوان سیال فوق بحرانی را نشان می دهد(67). با مقایسه بین سیال های فوق بحرانی این جدول می توان مشاهده نمود، دی اکسید کربن دارای ویژگی های منحصر به فردی است. دی اکسید کربن با قیمت پایین (بعد از آب ارزانترین حلال محسوب می شود) و خواص مناسب آتشگیر نبودن، سمی نبودن و تهیه آسان آن با خلوص بالا، سازگار بودن با محیط زیست و پایین بودن دما و فشار فوق بحرانی نسبت به سایر حلال ها، بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد. از طرفی CO2 نسبتاً بی اثر بوده و باگونه های دیگر کمتر واکنش داده و همچنین در دما و فشار اتاق به صورت گاز می باشد و به سادگی می توان با برداشتن فشار از روی نمونه، سیال را از گونه استخراج شده و یا محصول واکنش جدا نمود ونیاز به مراحل اضافی جهت جدا سازی حلال از آنها نمی باشد(69،64).
مقدار سطح آستانه (TLV) برای مواد شیمیایی عبارت است از غلظتی، که در هوا و در دمای 25 درجه سانتیگراد برای افرادی که هر روز در آزمایشگاه در معرض آن می باشند، اثرات مضر نداشته باشد. در مورد دی اکسید کربن TLV حدودL-1۰mg5000 می باشد که در مقایسه با حلال ها دیگر مانند کلرو فرم که TLV آن برابرL-1۰ mg10، پنتان با TLV برابر با L-1۰ mg600و یا استن با TLV برابر با L-1۰mg750، کار با آن بی خطرتر می باشد(66).
در عمل به خصوص در صنایع غذایی اغلب دمای بحرانی سیال پایین تر از 100 درجه سانتیگراد مطلوب می باشد تا به مواد غذایی آسیب نرسد. بنا براین حلال هایی که معمولاً بیشتر مورد توجه و استفاده قرار می گیرند گازهایی با وزن مولکولی پایین مثل دی اکسید کربن، اتان و پروپان می باشد.
در حالیکه سیال های فوق بحرانی دیگر به علت ویژگی هایی نظیر گران قیمت بودن (گازهای نجیب)، سمی بودن و یا آتشگیر بودن (بنزن، فلوروفرم، آلکانها، و آلکن ها )، بالا بودن شرایط دما و فشار فوق بحرانی (آب ، متانول و آمونیاک ) کمتر مورد استفاده قرار گرفته اند. در دی اکسید کربن فوق بحرانی اکثر ترکیبات غیر قطبی حل می شوند در صورتی که اغلب ترکیبات قطبی و پلیمرها در آن نا محلول می باشند. شاید تنها عیب دی اکسید کربن ناشی از حلالیت کم گونه حل شونده های شدیداً قطبی در آن باشد که این نقص را می توان با اضافه نمودن مقدار کمی از اصلاحگرهای نسبتاً قطبی (کمک حلال ها) مناسب نظیر اتانول ومتانول بهبود بخشید معمولاً در صنایع شیمیایی برای جدا سازی محصولات آبی و یا پسماندها از محلول آبی غلیظ از تقطیر استفاده می شود، اما روش های تقطیرمحلول های آبی انرژی زیادی مصرف نموده و تشکیل آزئوتروپ در آنها مانع استفاده از تقطیر ساده می شود. به همین دلیل از دیگر روش های استخراج ، مثل استخراج مایع ـ مایع به جای تقطیر ساده استفاده می شود. چون تجهیزات مورد نیاز برای انجام استخراج با سیال فوق بحرانی تا حدی پیچیده است، قیمت تمام شده اولیه برای تجهیزات آن ، اغلب بیشتر از دیگر روش های رایج، مثل استخراج با سوکسله می باشد، اما این تجهیزات را می توان به راحتی نصب نمود.
بازیابی کمی و تجزیه ای یک گونه در یک محدوده زمانی، تحت شرایط فشار و دمای مشخص از سیال فوق بحرانی با عبور حجم مشخصی از سیال و سرعت جریان معین از میان بافت نمونه ، نیاز به بهینه سازی این عوامل دارد. بازیابی کمی گونه شامل چندین مرحله است، که همگی به حلالیت کافی گونه حل شونده در سیال فوق بحرانی وابسته است. مراحل بازیابی گونه شامل، جابجایی موفق گونه حل شونده از سطح بافت نمونه به درون سیال فوق بحرانی ، انتقال سریع و کافی گونه حل شونده از ذرات بافت به سیال فوق بحرانی منبسط شده، انتقال گونه حل شونده به داخل ظرف استخراج و به دام اندازی کمی گونه از جریان سیال خروجی می باشد. از لحاظ اقتصادی برای بیشتر فرآیندهای استخراج مایع ـ مایع بازیابی حلال استخراج مصرفی مهم است که معمولاً با تقطیر که فرایندی زمان بر و انرژی بر می باشد، انجام می شود.
جدول ۱ـ۴ پارامترهای بحرانی برخی سیال های فوق بحرانی(67).
سیال فوق بحرانی دمای بحرانی
( ) فشار بحرانی
(بار) چگالی بحرانی
(g/Lit)
دی اکسیدکربن(CO2)
نایتروس اکسید(N2O)
آمونیاک(NH3)
آب(H2O)
متانول(CH3OH)
زنون(Xe)
آرگون(Ar)
کریپتون(Kr)
متان(CH4)
اتان (C2H6)
پروپان (C3H8)
بوتان نرمال(C4H10)
پنتان نرمال(C5H12)
هگزان نرمال(C6H14)
اتان(C2H4)
پروپان(C3H6)
فلوروفرم(CHF3)
بنزن(C6H6)
سولفورهگزافلورید(SF6) 1 /31
4/36
4/132
0/374
5/239
6/16
5/122ـ
8/63 ـ
6/82 ـ
2/32
7/96
0/152
6/196
5/234
2/9
8/91
2/26
5/289
5/45 8/73
5/72
2/113
6/220
8/80
3/58
6/48
9/54
0/46
7/48
5/42
0/38
7/33
3/30
4/50
0/46
5/48
2/49
7/37 466/0
453/0
235/0
322/0
273/0
099/0
531/0
912/0
163/0
207/0
220/0
228/0
232/0
234/0
214/0
228/0
525/0
003/0
737/0
اما برای بازیابی گونه حل شونده در سیال فوق بحرانی می توان با کاهش فشار از روی مخلوط ابتدا گونه حل شونده را از آن جدا نموده و سپس با استفاده از یک کمپرسور مناسب، گاز دی اکسید کربن رها شده را به سامانه برگرداند و دوباره مورد استفاده قرار داد.
استخراج با سیال فوق بحرانی نمونه های آبی با دی اکسید کربن فوق بحرانی روش مناسبی برای سنجش گونه های حل شونده غیر قطبی است. برای مثال مقدار ثابت توزیع،K ، برای بنزن چهار مرتبه نمایی از فنل بیشتر است. ثابت توزیع گونه حل شده نیز به صورت نسبت جزء مولی گونه حل شونده در سیال فوق بحرانی و فاز آبی تعریف می شود که با یک برآورد تقریبی جزء مولی می تواند با حلالیت گونه حل شونده در فازها جایگزین شود.
عموماً ترکیباتی که فرارند و یا کاملاً در آب حل نمی شوند، به آسانی تحت شرایط مورد استفاده در سیال فوق بحرانی استفاده می شوند و ترکیباتی که حلالیت بیشتری دارند، تمایل زیادی برای استخراج نشان نمی دهند. از این لحاظ استخراج با سیال فوق بحرانی نمونه های محلول در آب در دستگاه های ساده ای که اغلب برای استخراج با سیال فوق بحرانی جامدات استفاده می شود قابل رقابت با روش های استخراج پایدار وکلاسیک مایع ـ مایع نمی باشند زیرا نتایج بهتری با روش کلاسیک به دست آمده است.
استخراج با سیال فوق بحرانی نمونه های آبی همانند جامدات می تواند به صورت پیوسته و ایستا انجام شود. در این فرآیند شبیه به فرآیند استخراج مایع ـ مایع، ثابت توزیع حل شونده بین سیال فوق بحرانی و فاز آبی، کارآیی انتقال فاز برای بازیابی کمٌی گونه حل شونده و مساحت سطح حباب های سیال فوق بحرانی از اهمیت خاصی برخوردار می باشد. از آنجا که سیال فوق بحرانی دی اکسید کربن معمولاً در چگالی های بینg.mL-1 8/0ـ4/0 استفاده می شود، اساس استخراج پویا حرکت سیال فوق بحرانی از میان توده نمونه آبی به سمت بالا یا قطرات مایع به سمت پایین در ظرف استخراج می باشد.اصلاح قطبیت دی اکسیدکربن با افزودن حلال های قطبی آلی مثل متانول نیز مفید نخواهد بود زیرا اصلاح کننده های قطبی می توانند به راحتی در فاز آبی حل شوند. استفاده از سیال های فوق بحرانی قطبی تر شبیه نیتروز اکسید و یا آمونیاک به منظور استخراج با سیال فوق بحرانی مواد آلی از آب با مشکلات بیشتری همراه است(66) .
1-3-7- استخراج با کمک آنزیم ها:
آنزیم ها روی دیواره سلولی تاثیر وآن را می شکند. در گیاهانی که فرآیند استخراج به کمک آنزیم در مورد آنها به اجرا درآمده است دیواره سلولی معمولاً از ترکیباتی نظیر مواد پکتیکی، سلولز، همی سلولز و چربی های آمیخته با پروتئین ها ساخته شده که با توجه به این پیچیدگی ساختمانی، حد و اندازه تجزیه آنزیمی و دیواره سلولی توسط فاکتورهایی نظیر اجزاء، جزئیات ترکیب شیمیایی، نوع و منبع آنزیمی تعیین می گردد. در عمل سیستم های آنزیمی چند منظوره استفاده می گردد(64) .
انواع آنزیم ها:
دیواره سلولی گیاهان از مواد پکتیکی، سلولوتیک و سایر مواد به صورت جزئی تشکیل شده که ساختار این مواد و آنزیم ها به شرح زیر است:
1-3-7-1- پکتین ها و پکتینازها:
پکتین ماده سیمانی بین سلولی گیاهی بوده و در بخش دیواره میانی قرار گرفته است. زمانی که میوه نارس است این ماده به صورت پروتوپکتین می باشد که در آب نامحلول است و شامل سلولز و مواد پکتیکی است. در طول رسیدن میوه پروتوپکتین به پکتین تبدیل شده و بافت میوه نیز نرم می شود.
چهار نوع آنزیم پکتیکی وجود دارند که با توجه به اثر بر سوبستراهای مختلف متفاوتند:
1ـ پکتین استراز( پکتاز):
در گیاهان عالی، باکتریها و قارچ ها یافت می شود و به مقدار زیاد در مرکبات و گوجه فرنگی وجود دارد. گروههای متوکسیل را از پکتین با متوکسیل بالا برداشته و متانل بعلاوه پکتین با متوکسیل پایین تولید می کند. این آنزیم برای آغاز عمل خود به یک گروه کربوکسیل آزاد ـ در مجاورت گروه استری شده ـ نیاز دارد. بنابراین پلی گالاکترونیک اسیدی که کاملاً متیله شده باشد تحت اثر آن قرار نمی گیرد. بصورت خطی در طول زنجیر حرکت می کند تا به مانعی برسد. وجود کاتیون های دوظرفیتی فعالیت این آنزیم را چندین مرتبه افزایش می دهد.
2ـ پلی گالاکتروناز(پکتیناز):
این آنزیم یک دیپلیمراز بوده و اتصالات گلیکوزیدی را در مواد پکتیکی هیدرولیز می کند. این آنزیم به دو صورت اند و اگزو فعالیت می کندو حاصل عمر آن بر روی پکتین، اسید گالاکترونیک و استر متیله اسید گالاکترونیک است. اندو به طور تصادفی در رشته فعالیت می کند و اگزو پیوندهای انتهایی زنجیر را می شکند.
3ـ پکتین لیاز :
این آنزیم مشابه با اندو پلی گالاکتروناز عمل می کند با این تفاوت که بر روی باندهای میانی مو لکول های متیله شده اثر می گذارد.
4ـ پکتات لیاز :
این آنزیم به طور تصادفی در شکستن پیوندهای گلیکوزیدی بین مولکولهای اسید گالاکترونیک متیله نشده در پکتین با متوکسیل پایین عمل می نماید. عمل شکستن پیوند گلیکوزیدی به شکلی انجام می شود که با جدا شدن اتم هیدروژن از کربنهای 4و5 و به دنبال آن تشکیل پیوند دوگانه میان این دو کربن همراه می باشد.
1ـ3ـ7ـ2ـ همی سلولز و همی سلولاز :
همی سلولزها، پلی ساکاریدهای غیر نشاسته ای و غیر سلولزی موجود در بافتهای بسیاری از گیاهان هستند. همی سلولزها از پلی ساکاریدهای نا محلول هستند. همی سلولز ماده متشکله سلولز نیست و در بیو سنتز آن شرکت نمی کند و به صورت مستقل به عنوان یکی از اجزای ساختار دیواره ی سلولی گیاهان می باشد. همی سلولزها با توجه به قندهای زیر طبقه بندی می شوند
همی سلولزهای گزیلان، مانان و گالاکتان که به ترتیب پلی مرهای گزیلوز، مانوز و گالاکتوز می باشند. اکثر همی سلولزها هتروپلی ساکارید هستند و معمولاً دارای 2تا4 واحد قند مختلف می باشند. اکثر قندهایی که در همی سلولز یافت می شود عبارتند از گزیلوز و ارابینوز.
آنزیم های آرابیناز بر سه نوع اند :
1ـ آرابینوزیداز A : الیگومرهای آرابینان را به مونومرها تجزیه می کنند.
2ـ آرابینو زیداز B : شاخه های آرابینان را تجزیه کرده و با برداشتن پیوند آلفا ـ1به 3 انتهایی متصل به رشته های جانبی یک زنجیر خطی ایجاد می نماید. در همین زمان این آنزیم به طور مداوم گروه انتهایی آرابینوز را از انتهای غیر احیا کننده زنجیر خطی جدا می کند. آنزیم آندو آرابیناز، بطور تصادفی زنجیر خطی را هیدرولیز می کند و آن را به الیگومرها می شکند که آرابیناز A می تواند بر آن عمل نیاید.
3ـ گالاکتانازها، به دو صورت آندو گالاکتاناز می باشند که آندو گالاکتاناز بطور تصادفی بر رشته گالاکترونیک اسید با شکستن اتصالات بتا ـ 1به 4 اثر می گذارد،در حالیکه گالاکتاناز به طور تصادفی عمل می کند تا باندهای بتا ـ1به3 و بتا ـ1به6 را بشکند.
1ـ3ـ7ـ3ـ سلولز وسلولاز :
یک زنجیر خطی از مولکول های گلوکز با اتصال بتا ـ1به4 می باشد واین زنجیرها می توانند تشکیل پیوندهای هیدروژنی با همدیگر در امتداد طولشان دهند که منجر به شکل گیری مجموعه ای به نام میوفیبریل گردد. خواص سلولز می تواند متفاوت باشد و بستگی به درجه پلیمریزاسیون و درجه کریستالی شدن دارد. سلولز با درجه پایین تر کریستالی شدن، با کمک آنزیم راحت تر تجزیه می گردد. سلولاز، سیستمی از آنزیم ها شامل آند گلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز (بتا ـ گلوکوزیداز) می باشد. آندوگلوکوناز بطور تصادفی پیوند بتا ـ 1به4 گلوکز در زنجیر را هیدرولیز کرده، در حالی که اگزوگلوکاناز، فقط پیوند را از انتهای غیر احیاء کننده شکسته تا به گلوکز، یا دیمر سلوبیوزی خود تبدیل نماید. سلوبیاز، سلوبیوز را به دو مولکول گلوکز می شکافد. سلوبیوز به شدت از فعالیت آندو و اگزو گلو کانز جلوگیری می نماید، بنابرین سلوبیاز در کمپلکس سلولاز ضروری می باشد.
فصل دوم
مروري بر تحقيقات انجام شده
2-1- مروری برچند نمونه از کاربرد آنزیم ها در استخراج لیکوپن:
مقالات مروری:
آقای zuoroo و همکارانش مطالعه ای با موضوع “استخراج لیکوپن از ضایعات گوجه فرنگی به کمک آنزیم” را داشتند که در این مطالعه شرایط بهینه استخراج لیکوپن را از گوجه فرنگی و با استفاده از آنزیم های سلولاز وپکتیناز، استون، اتانول وهگزان را بدست آوردند. شرایط بهینه بدست آمده برای این فرآیند عبارتند از: حجم 50 : 50 آنزیم سلولاز وپکتیناز، بار آنزیمی 0.16 کیلوگرم/کیلوگرم، دمای 30 درجه سانتیگراد و زمان استخراج 18/3 ساعت می باشد که از مزایای این روش افزایش 8 تا18 درصدی استخراج شد (33).
آقای Sheet وهمکارانش مقاله ای تحت عنوان “استخراج لیکوپن از بافت گوجه فرنگی به کمک آنزیم” داشتند که در این مقاله لیکوپن با استفاده از استخراج آنزیمی و تحت شرایط بهینه با استفاده از غلظت های مختلف سلولاز و پکتیناز از پوست و بافت گوجه فرنگی استخراج گردیده است. شرایط بهینه استخراج عبارت است از: آنزیم سلولاز (45 واحد فعالیت با pH=4.5) ، آنزیم پکتیناز ( 574/89 واحد فعالیت با PH=5.0) با 3 گرم نمونه در بافر استات 0.2M در دمای 45 و55 درجه سانتیگراد که در پایان به این نتیجه رسیدند که بیشترین مقدار لیکوپن در پوست گوجه ذخیره شده است و در نهایت استخراج گردید (68).
Roberto Lavecchia و همکارانش مقاله ای تحت عنوان “بهبود استخراج لیکوپن از پوست گوجه فرنگی توسط تیمار آنزیمی” داشتند که در این مقاله با تاثیر نوع حلال و زمان انکوباسیون آنزیم در بازده استخراج مورد مطالعه قرار گرفت که بهینه شرایط بدست آمده عبارتند از: 1 ساعت زمان انکوباسیون آنزیم به دنبال 3 ساعت زمان استخراج حلال در دمای 40 درجه سانتیگراد که در این شرایط تا حدود 440 میلی گرم لیکوپن در 100 گرم پوست گوجه فرنگی استخراج گردید. در این برسی استخراج لیکوپن توسط تیمار آنزیمی به حدود 70 تا 90 درصد افزایش یافته است در حالی که در بخش تیمار نشده در حدود 3 تا 40 درصد بوده است (71) .
Alice Lee و همکارانش مقاله ای تحت عنوان استخراج لیکوپن از گوجه فرنگی با روش مافوق صوت داشتند که در این مقاله استخراج لیکوپن با کمک مافوق صوت با روش سطح پاسخ انجام شد در این برسی 6 تکرار در دمای 40 درجه سانتیگراد و در زمان 40 دقیقه و %70 وزنی- حجمی انجام شد که منجر به افزایش 26 درصدی استخراج شد با استفاده از شرایط بهینه سازی با زمان استخراج 6/45 دقیقه و دمای استخراج 6/47 و نسبت حجمی 74.4:1 عملکرد نسبی %99 می باشد (23) .
Liu Zelong و همکارش بهینه سازی استخراج لیکوپن را در دو روش مافوق صوت(UAE) و مافوق صوت\مایکروویو(UMAE) ازگوجه فرنگی را با هم مقایسه کردندو عملکرد لیکوپن درشرایط بهینه در روش مافوق صوت ( دمای استخراج 86.4 درجه سانتی گراد، نسبت حلال به خمیر گوجه فرنگی (W\V) 8.0:1، زمان استخراج 29.1 دقیقه) 89.4 درصد وبرای روش مافوق صوت\مایکروویو در شرایط بهینه استخراج ( قدرت مایکرووی,W98 همراه KHZ40 فرآیند مافوق صوت، نسبت حلال به خمیر گوجه فرنگی (W\V) 10.6:1، زمان استخراج 367 ثانیه) 97.4درصد بود(80).
Venkatasubramanian.S و همکارانش استخراج مافوق صوت را درگیاهان مختلف مورد بررسی قرار دادندبا استفاده از مطالعات تحلیلی ( مانند اسپکتروسکوپی ) که روی عصاره انجام دادند به این نتیجه رسیدند که حدود 13 تا 100 درصد افزایش راندمان مشاهده شده است ( 81 ).
آقای choud hari و همکارانش فرآیند آنزیمی لیکوپن از بافت گوجه فرنگی را با استفاده از آنزیم های سلولاز و پکتیناز را مورد بررسی قرار دادند و شرایط بهینه استخراج را بدست آوردند. افزایش قابل توجه بازده لیکوپن به ترتیب برای نمونه های تیمار شده سلولاز و پکتیناز (107%) g\lg 429 و (206%) g\lg 1104 بود (82).
فصل سوم
مواد- روش ها و تجهیزات
در این فصل مواد و تجهیزات و روش هایی که در این پروژه مورد استفاده قرار گرفته اند را شرح خواهیم داد.
3-1- مواد مورد استفاده :
موادی که در این کار مورد استفاده قرار می گیرند عبارتند از :
1- ضایعات گوجه فرنگی(پوست گوجه فرنگی)
2- آنزیم سلولاز( Cellulase) ، پودر سلولاز خام دارای حداقل واحد فعالیت 5/0 در میلی گرم پودر آن، مخصول شرکت Sigma که به صورت بسته بندی 1 گرمی خریداری گردید.
3- الکل اتیلیک
4- هگزان
5- استون
که الکل اتیلیک، استون و هگزان حلال های مورد استفاده برای اندازه گیری کل مقدار لیکوپن در پوست گوجه فرنگی استفاده شد.
6- اسید استیک ( Mark )
7- سدیم
که اسید استیک و سدیم استات به صورت محلول 2/0 نرمال به عنوان بافر مورد استفاده قرار گرفت.
ردیف نام دستگاه مشخصات دستگاه
1 شیکر انکوباتور DAIK DK-S1060
2 pH متر 3 ترازوی دیجیتال بادقت 001/0گرم
4 سانتریفیوژ UNIVERSAL 320 R
6 اسپکتوفتومتر 5 اولتراسوند 2100- UV
3-2- تجهیزات مورد استفاده :
