عضو شوید
عضویت سریع
تبادل لینک هوشمند 
آمار مطالب
آمار بازدید
فصل دوم : سابقه و پیشینه تحقیق
2-1- مروری بر تحقیقات پیشین22
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1- مواد و تجهیزات مورد نیاز 30
3-1-1- تجهیزات و دستگاه ها30
3-1-2-مواد مصرفی31
3-2- محلول سازی31
3-2-1- ملاحظههای ایمنی واحتیاطات32
3-3-شاخص های اصلی طرح32
3-4-شمای کلی انجام طرح33
3-4-1- انجام مرحله اول پژوهش33
3-4-1- 1 – استخراج35
3-4-2-1- آماده سازی ستون ایمونوافینیتی36
3-4-1-3- تخلیص36
3-4-1-4- اسپایک گذاری36
3-4-1-5 آفلاتوکسین ها37
3-4-1-6- آزمایش‌های انجام شده در این مرحله پژوهش37
3-4-1-7-محاسبات37
3-4-2-اندازه گیری آفلاتوکسین M1 در ماست37
3-4-2-1- آماده سازی و تهیه نمونه.37
3-4-3- انجام مرحله سوم پژوهش38
3-4-3-1- آماده سازی و فرایند طراحی نمونه ها38
3-4-3-2- فراوری نمونه ها38
3-4-4-آنالیزهای مورد استفاده در این فاز پژوهش39
3-4-4-1-. اندازه گیری pH39
3-4-4-2-آزمون اسیدیته39
3-4-4-3- شمارش میکروبی39
3-4-5- انجام مرحله چهارم پژوهش39
3-4-5-1- آنالیزهای این مرحله از پژوهش40
فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری
4-1- غلظت آفلاتوکسین43
4-1-1- مقایسه غلظت آفلاتوکسین در غلظت های05/0و1/0مایکرولیتر 43
4-2- اثر تیمار های آزمایش بر تعداد باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس43
4-2-1- مقایسه تعداد باکتری لاکتو باسیلوس بولگاریکوس در زمان های تخمیر44
4-2-2مقایسه تعداد باکتری استرپتوکوکوس ترموفیلوس درزمان های تخمیر45
4–2-3 مقایسه تعداد باکتری های لاکتو باسیلوس بویگاریکوس در هفته های مختلف نگهداری دوغ46
4-2-4 مقایسه تعداد باکتری های استرپتو کوکوس ترموفیلوس در هفته های مختلف نگهداری دوغ46
4-3 اثر تیمار های آزمایش بر پی اچ و اسیدیته 47
4-3-1 مقایسه میانگین تیمار در ساعت های مختلف تخمیر برای پی اچ و اسیدیته47
4-3-2 مقایسه اثر تیمار بر پی اچ در هفته های مختلف نگهداری دوغ48
4-3-3مقایسه اثر تیمار بر اسیدیته در هفته های مختلف نگهداری دوغ50
4-3-4 مقایسه اثر تیمارهای مختلف در هفته های مختلف نگهداری دوغ برای پی اچ و اسیدیته50
4-4 اثر چربی بر ویژگی های مورد مطالعه50
4-4-1 اثر چربی بر ویژگی های مورد مطالعه در شرایط تخمیر51
4-4-2اثر چربی بر ویژگی های مورد مطالعه در هفته های نگهداری دوغ 52
4-5 بررسی تغییرات آفلاتوکسین در طی زمان تخمیر تا انتهای زمان نگهداری دوغ52
4-6 بررسی اثر آفلاتوکسین بر روی باکتری های لاکتوباسیلوس بولگاریکوس واسترپتوسوکوس ترموفیلوس53
4-6-1بررسی اثر آفلاتوکسین بر روی باکتری های لاکتو باسیلوس بولگاریکوس54
4-6-2بررسی اثر آفلاتوکسین بر روی باکتری های استرپتوکوکوس ترموفیلوس54
4-7 اثر آفلا توکسین بر روی پی اچ55
4-8 اثر آفلاتوکسین بر روی اسیدیته56
4-9 بررسی اثر چربی بر روی غلظت آفلاتوکسین و تعداد باکتری ها56
4-10 نتیجه گیری56
4-11 پیشنهادات56
منابع57 فهرست جداول
صفحه عنوان
3-1 – تجهیزات و دستگاه های مورد استفاده30
3-2- مواد مصرفی و تجهیزات مورد نیاز جهت آزمون های میکروبی31
3-3- مقادیر مورد نیاز از محلول های استاندارد کاری جهت تهیه منحنی کالیبراسیون34
4-1- جدول مقایسه غلظت آفلاتوکسین42
4-2- جدول مقایسه میانگین های pH واسیدیته طی زمان تخمیرساعت تخمیر46
4-3- جدول مقایسه میانگین pH درطی 21 روز نگهداری دوغ47
4-4- جدول مقایسه میانگین های اسیدیته درطی21 روز نگهداری دوغ48
4-5- جدول مقایسه میانگین های pH واسیدیته طی 21 روز نگهداری دوغ49
4-6- جدول مقایسه میانگین های دوغ با 1 درصد چربی ودوغ بدون چربی با تمامی صفات مورد بررسی در زمان تخمیر50
4-7- جدول مقایسه میانگین های دوغ با 1 درصد چربی ودوغ بدون چربی با تمامی صفات مورد بررسیدر هفته های نگهداری دوغ51
فهرست نمودارها
صفحه عنوان
نمودار3-1-منحنی کالیبراسیون35
نمودار4-1- مقایسه تعداد باکتری های لاکتوباسیلوس بولگاریکوس در زمان ها ی تخمیر43
نمودار4-2- مقایسه تعداد باکتری ها استر پتوکوکوس ترموفیلوس در زمان های تخمیر44
نمودار4-3- مقایسه میانگین تعدادباکتریهای لاکتوباسیلوس بولگاریکوس در 21 روز زمان نگهداری دوغ45
نمودار4-4- مقایسه میانگین تعدادباکتریها ی ا سترپتوکوکوس ترموفیلوس درطی 21 روز نگهداری دوغ45
چکیده:
در این پژوهش اثر آغازگرهای لاکتیکی لاکتوباسیلوس دلبروکی زیر گونه بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس ، بر روی تغییرات غلظت آفلاتوکسین M1 که در دو غلظت 05/0 و 1/0 مایکرو گرم بر لیتربه طور مصنوعی به شیر باز ساخته با 1 درصد چربی در دمای 42 درجه سانتی گراد اضافه شده بود و در طی زمان تخمیر ماست و21 روز نگهداری دوغ در یخچال بررسی شد. محاسبه غلظت آفلاتوکسینM1 به وسیله کرماتوگرافی مایع با عملکرد بالا مورد بررسی قرار گرفت همچنین شاخص های pH ، اسیدیته قابل تیتر، چربی، غلظت آفلاتوکسین وتعداد باکتری ها اندازه گیری شدند. نتایج نشان داد که آغازگرهای ماست تاثیر بسزایی در کاهش غلظت آفلاتوکسین داشتند درصد کاهش غلظت آفلاتوکسین M1 در دوغ 05/0 میکروگرم بر لیتر در انتهای زمان تخمیر22 درصد و در انتهای 21 روز نگهداری 31 درصد و در دوغ 1/0 مایکروگرم بر لیتر به ترتیب 4/22 و 28 درصد بود. در نمونه هایی که دارای غلظت آفلاتوکسین بیشتری بودندکاهش رشد استرپتوکوکوس ترموفیلوس را به طور معنی داری (p<0/01) شاهد بودیم. اثر چربی بر روی افزایش رشد لاکتوباسیلوس دلبروکی زیر گونه بولگاریکوس و کاهش غلظت آفلاتوکسین به طور معنی داری(p<0/01) مشهود بود.
لغات کلیدی: آفلاتوکسین M1 ، باکتری های آغازگر ماست، چربی، کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا، زمان نگهداری
فصل اول:
کلیات تحقیق
1-1- مقدمه
مایکوتوکسین ها متابولیت های ثانوی هستند که به وسیله گونه های قارچی تولید شده و بر روی انسان حیوانات و میکروارگانیسم ها اثر سمی دارند. تاکنون در حدود هزار نوع از مایکوتوکسین ها شناخته شده اند که حدود 30 تا 40 نوع از آن ها از نظر فرمول شیمیایی شناسایی وسمیت آن ها به اثبات رسیده است. از میان مایکوتوکسین ها ،آفلاتوکسین ها به خاطر اثرات بالقوه سرطان زایی،ناقص الخلقه زایی و جهش زایی اهمیّت بیشتری دارند و در ایجاد سرطان کبد، هپاتیت مزمن و سیروز کبد مؤثرند. آفلاتوکسین M1 از مشتقات 4- هیدروکسی آفلاتوکسین B1 می باشد که در شیر پستاندارانی که خوراک حاوی آفلاتوکسین B1 را مصرف می کنند، دفع می شود(آدامز و مود،2000).
آفلاتوکسین ها اغلب در محصولات کشاورزی پیش از برداشت آنها تولید می شوند. بعد از برداشت محصول نیز چنانچه خشک کردن آن به تأخیر بیافتد و یا درطی نگهداری در انبار، رطوبت از حد بحرانی تجاوز کند، شرایط برای رشد قارچ های مولد توکسین آماده شده و آلودگی اتفاق می افتد.آفلاتوکسین ها در انواع مختلف مواد غذایی و محصولات کشاورزی از جمله شیر ، پنیر ، ذرت ، بادام زمینی ، پنبه ، گردو ، فندق ، بادام و انجیر شناسایی شده اند. این ترکیبات ممکن است در گوشت طیور و دام هایی که با غذای آلوده به آفلاتوکسین ها تغذیه شده اند نیز ظاهر شوند. ذرت ، بادام زمینی و پنبه از محصولاتی هستند که بسیار مستعد آلودگی به آفلاتوکسین ها می باشند(کریم و همکاران،1378). دوغ یکی از فرآورده های تخمیری شیر است که می توان از ماست، آب کره و یا آب پنیر تهیه کرد. دوغ تهیه شده در این کارخانه از ماست می باشد و به دو نوع گازدار و بدون گاز است(حصاری و منافی،1389). در این تحقیق امکان اتصال آفلاتوکسینM1 به باکتری های لاکتیکی در دوغ 1 درصد چربی مورد بررسی و آزمایش قرار گرفته است. عواملي كه در ميزان توليد مايكوتوكسين ها مؤثر مي باشند به فاکتورهای فيزيكي، شيميايي و بيولوژيك تقسيم شده اند. عوامل فيزيكي، عواملي را در بر مي گيرد كه بر روي وضعيت محيطي مؤثردر ايجاد كلني هاي قارچي مانند دما، رطوبت نسبي و آلودگي با حشرات تأثير گذار مي باشد. از اثرات شيميايي مي توان به كاربرد انواع قارچ كش ها اشاره نمود و از اثرات بيولوژيك مي توان تأثيرات ساير گونه هاي قارچي در زمان رشد آسپرژيلوس اشاره نمود(ایسمیر و رستون،1996).
با توجه به نياز عمومي بين المللي در زمينه بهداشت مواد غذايي، آلود گي انواع مواد غذايي به مايكوتوكسين ها بسيار مورد توجه قرار گرفته است. اين مسئله منجر به تدوين و ارزيابي آلودگي شير به آفلاتوكسين توسط كميته تخصصی GESFA براي ارزياي تخصصي سم شناسي در اين زمينه گرديد. كدكس به عنوان سازمان بين المللي وظيفه ايجاد تسهيلات مربوط به مقررات مربوط به مواد غذايي براي تسهيل در تبادلات تجاري را دارد و در اين زمينه استاندارد آفلاتوکسین M1 را در شیر در حد 5/0 پی.پی.بی تدوین نموده است(تاج کریمی و همکاران،1386). آفلاتوکسین M1حاصل متابولیت ثانویه آفلاتوکسینB1 در بدن نشخوارکنندگان است. آفلاتوکسینB1 از طریق غذای آلوده به بدن حیوان راه یافته و بعد از متابولیزه شده به آفلاتوکسینM1 تبدیل می شود. گزارشات نشان داده که این سم به عنوان مهمترین آلاینده در شیر باقی می ماند و خطرات بسیار جدی برای مصرف کننده به دنبال دارد(خاکسار و همکاران،1386). تحقیق حاضر با توجه به اهمیّت مصرف شیر و فراورده های لبنی نظیر ماست و دوغ انجام گرفت.
1-2- ارائه مسأله پژوهش و بیان هدف:
1-2-1- مسأله پژوهش:
آیا امکان اتصال آفلاتوکسین 1M به باکتری های لاکتیکی در دوغ 1 درصد چربی وجود دارد؟
1-3- اهداف تحقیق:
1-3-1- هدف کلی تحقیق:
دستیابی به روشی سالم و بدون ضرر جهت حذف سم آفلاتوکسین در فرآورده تخمیری شیر كه از نظر تغذیه(انسان) هيچگونه خطري نداشته باشد.
1-4- فرضیه ها:
فرضیه های این تحقیق شامل موارد زیر است:
الف. باکتری های لاکتیکی می توانند در مقادیرمختلف آفلاتوکسین تأثیر بگذارند.
ب. میزان مقادیرمختلف آفلاتوکسین می تواند بر باکتری های لاکتیکی تأثیر بگذارد.
پ. زمان های مختلف نگهداری در مقادیر مختلف آفلاتوکسین تأثیر معنی دار دارد.
1-5- آفلاتوکسین ها
آفلاتوکسین ها توسط سه گونه آسپرژیلوس به نام های آسپرژیلوس فلاووس ، آسپرژیلوس پارازیتیکوس ، و گونه هایی از آسپرژیلوس نومیوس تولید می شوند. آسپرژیلوس فلاووس آفلاتوکسینB را ایجاد می کند، در حالی که دو گونه دیگر هر نوع آفلاتوکسین BوG را تولید می نمایند(تجلی و همکاران،1390) .
با توجه به سمیت و خطرات بالقوه افلاتوکسین ها، سازمان ها و نهادهای نظارتی کشورها از جمله FDA بیشترین سطح مجاز آفلاتوکسین M1 در شیر وفراورده های شیری را تعیین کرده اند و حضور آن را در زنجیره تولید وفراوری با حساسیت کنترل می کنند. با توجه به اینکه منشأ آلودگی شیر به آفلاتوکسینM1 ، مصرف خوراک آلوده به آفلاتوکسین B1 توسط دام می باشد ، باید روش های مناسب تولید و نگهداری به کار گرفته شود تا خوراک دام ها تا حد امکان از آلودگی مصون بماند(مرتضوی و طباطبایی،1376).
وجود ذرت و کنجاله پنبه آلوده به آفلاتوکسین در جیره گاو های شیری باعث آلودگی شیر و محصولات لبنی به آفلاتوکسین M1 می شود. هضم غذای آلوده به آفلاتوکسین در حیوانات منجر به دفع آفلاتوکسین M1 در شیر در طی 12 تا 24 ساعت می شود. لازم به ذکر است که فقط 2/2- 4/0 درصد از آفلاتوکسین B1 به صورت آفلاتوکسین M1 در سطح 07/0-02/0 میکروگرم در لیتر شیر شود. مقدار آفلاتوکسین M1 و سمیت آن در شیر پس از پاستوریزاسیون شیر تغییر محسوسی پیدا نمی کند. از آنجایی که آفلاتوکسین M1 محلول در آب است، بنابراین با جدا کردن چربی غلظت آن در شیر افزایش می یابد. در جریان خامه گیری و جدا کردن چربی فقط 10و2 درصد از آفلاتوکسین M1 موجود در شیر اولیه به ترتیب به خامه و کره راه می یابند(المر و جیمز،2001).
عواملي كه در ميزان توليد مايكوتوكسين ها مؤثر مي باشند به عوامل فيزيكي، شيميايي و بيولوژيك تقسيم شده اند .عوامل فيزيكي، عواملي را در بر مي گيرد كه بر روي وضعيت محيطي مؤثردر ايجاد كلني هاي قارچي مانند دما، رطوبت نسبي و آلودگي با حشرات تأثير گذار مي باشد. از اثرات شيميايي مي توان به كاربرد انواع قارچ كش ها اشاره نمود و از اثرات بيولوژيك مي توان تأثيرات ساير گونه هاي قارچي در زمان رشد آسپرژيلوس اشاره نمود(ایسمیر و رستون،1996).
1-5-1- ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین ها
آفلاتوکسین ها از نقطه نظر شیمیایی مشتقات فورانوکومارین محسوب می شوند. این ترکیبات هتروسیکلیک وزن مولکولی پایینی داشته و بر اساس منشأ اولیه ، Rf و نور فلورسانسی که در حضور اشعه فرابنفش دارند به چهار گروه اصلی B1،B2،G1 و G2 تقسیم می شوند. آفلاتوکسین های B1 و B2 در طول موج 425 نانومتر و G1, G2 در طول موج 450 نانومتر اشعه فرابنفش به ترتیب به رنگ آبی و سبز ـ زرد فلورسانس می کنند(المر و جیمز،2001). .
گونه های مسمومیت زای آسپرژیلوس به طور معمول 2 یا 3 فرم از آفلاتوکسین ها را سنتز می کنند که یکی از آن ها به طور ثابت آفلاتوکسین B1 است. آفلاتوکسین B1 سمی قوی است و در گروه ترکیبات سرطان زا قرار دارد. هنگامی که گاو شیری غذای آلوده به آفلاتوکسین را دریافت می کند، آفلاتوکسین B1, B2 به مشتقات 4 ـ هیدروکسی خود به نام های آفلاتوکسین M1 و M2 تبدیل و از شیر دفع می شوند. غلظت آفلاتوکسین M1 تولیدی در شیر گاو نسبت به آفلاتوکسین M2 بیشتر بوده و سمیت آن نیز به مراتب بیشتر می باشد(رحیمی و همکاران،210).
1-5-2- آفلاتوکسین M1 :
آفلاتوکسین M1 دارای نقطه ذوب 299 درجه است. با استفاده از میکرو آنالیز و طیف سنجی جرمی نشان دادند که فرمول تجربی آفلاتوکسین M1 نسبت به آفلاتوکسین B1 یک اتم اکسیژن بیشتر دارد. شباهت نزدیک داده های مربوط به طیف فرابنفش آفلاتوکسین های M1 و B1 نشان می دهدکه سیستم کوروموفوریک در این دو ترکیب مشابه است. طیف مادون قرمز آفلاتوکسین M1 نیز مشابه B1 و دارای دو پیک در 1760cm-1 و 1690cm-1 می باشد. باند جذبی در 3425cm-1 نشان می دهد که آفلاتوکسین M1 دارای یک گروه هیدروکسیل است(هولزپفل و استین،1996). آفلاتوکسین M1 از مشتقات 4 ـ هیدروکسی آفلاتوکسین B1 می باشد که در شیر پستاندارانی که خوراک حاوی آفلاتوکسین B1 را مصرف می کنند، دفع می شود. فرمول مولکولی آن C17H12O7 است(آدامز و مود،2000).
آفلاتوکسین های M1 و M2 متابولیت های هیدروکسیله آفلاتوکسین های B1 و B2 هستند و در شیرو محصولات شیری دام هایی که غذای آلوده حای آفلاتوکسین B تغذیه کرده اند،یافت می شوند.گرچه سمیت آفلاتوکسین M1 نسبت به آفلاتوکسین B1 کمتر می باشد ولی وجود آن در شیر بویژه برای کوکان که مصرف بالاتری از شیر و فراورده های لبنی دارند، به عنوان یک خطر بهداشتی محسوب می گردد. معمولا ًمقدار آفلاتوکسین M1 در شیر بیشتر از آفلاتوکسین M2 بوده و سمیت ان نیز شدیدتر است(هولزپفل و استین،1996). به علاوه در مطالعات مختلف چهار نوع آفلاتوکسین اصلی به نام های B1، B2، G1 و G2 شناسایی شدند. علاوه بر این، دو نوع متابولیت تولید شده از آن ها به نام های M1 و M2 که باعث آلودگی مستقیم غذای انسان و حیوانات می شوند، معرفی گردید(جی،1992). (Jay,1992).
هنگامی که گاو شیری غذای آلوده به آفلاتوکسین B1 را مصرف می کند، این نوع آفلاتوکسین به آفلاتوکسین M1 متابولیزه می شود که قسمتی از آن از طریق شیر دفع می گردد(المر و جیمز،2001). نتایج مطالعات نشان می دهد که سرطان زایی آفلاتوکسین M1 نسبت به B1 کمتر است. با توجه به اهمیّت آفلاتوکسین ها، در سال 1997 ، 66 کشور پیشنهادی را درباره تعیین محدوده مجاز آفلاتوکسین ها در مواد غذایی مطرح کردند. بر این اساس در ایالات متحده آمریکا و نیز اتحادیه اروپا حداکثر مقدار مجارز آفلاتوکسین M1 در شیر نوشیدنی و شیر مورد استفاده به عنوان غذای کودک به ترتیب 5/0 و 1/0 قسمت در بیلیون تعیین شد(المر و جیمز،2001).
تصور می شود پایین بودن سطح آفلاتوکسین M1 در ماه ژوئن در مطالعات انجام شده توسط باکرسی، بیشتر به خاطر چرای بیرونی دام های شیرده باشد(باکرسی،2001). نتایج مشابه نیز توسط دیگر محققان به دست آمده که نشان می دهد که سطح پایین آفلاتوکسین M1 و یا عدم تولید آن مربوط به فصل تابستان می باشد(فلاح و همکاران،2009.،البرزی و همکاران،2006).
شکل1-1- انواع آفلاتوکسین ها
شکل1-2- مکانیسم های تولید آفلاتوکسین M1
1-6- فاکتورهای مؤثر در تولید آفلاتوکسین ها
رشد آسپرژیلوس ها و تولید آفلاتوکسین توسط آنها به شرایط محیطی ، نوع سوبسترا و حضور سایر گونه های قارچی بستگی دارد. با توجه به گزارش های ضد و نقیضی که در رابطه با خاصیت توکسین زایی قارچ آسپرژیلوس دردست است، محققان به این نتیجه رسیده اند که این مسئله هم به خاکی که آسپرژیلوس فلاووس از آن جدا شده و هم به منطقه جغرافیایی آن مربوط می باشد. منطقه جغرافیایی در تولید آفلاتوکسین توسط آسپرژیلوس فلاووس نقش اساسی دارد، به طوری که به نظر می رسد قارچ های آسپرژیلوس که از مناطق حاره جمع آوری شده اند بیش از انواع جدا شده از مناطق معتدل ، مولد سم باشند(یوسفی،1369).
آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس در مناطق گرمسیری نیمه گرمسیری بسیار پراکنده اند. در این نواحی به علت نگهداری نامناسب محصولات کشاورزی در انبار، قارچ های مختلف از قبیل آسپرژیلوس و پنی سیلیوم به سرعت رشد می کنند. گرمای هوا و رطوبت بالا باعث می شود که میزان تولید آفلاتوکسین ها به سرعت افزایش یابد و اغلب از محدوده تعیین شده توسط FAO وWHo که 30 میکروگرم در کیلوگرم برای مصارف غذای انسان است،بالاتر رود(هولپزفل و استین،1996).
امروزه مشخص شده که تولید آفلاتوکسین ها فقط در نتیجه نگهداری نامناسب در انبار نمی باشد بلکه این سموم می توانند قبل از برداشت محصول نیز تولید شوند. استرس آبی، استرس دمایی و صدماتی که حشرات به گیاه میزبان در مزرعه وارد می سازند، فاکتورهای اصلی برای هجوم قارچ ها و تولید سموم قبل از برداشت محصولات می باشد(مرتضوی و طباطبایی،1376.،آدامز و موس،2000).
شکل گیری آفلاتوکسین ها همچنین در ارتباط با رشد سایر قارچ ها ومیکروب ها می باشد. آسپرژیلوس نیجر مهمترین ارگانیسم رقیب آسپرژیلوس فلاووس محسوب می شود. مطالعات انجام شده نشان دادند، درصورتی که آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس نیجر توأماً به پسته های اتوکلاو شده تلقیح شوند، آفلاتوکسین تولید نخواهد شد. مهمترین مکانیسم احتمالی در مهار تولید آفلاتوکسین کاهش pH محیط در اثر تولید مقادیر زیاد اسیدهای آلی از جمله سیتریک اسید به وسیله آسپرژیلوس می باشد. افزون بر این، احتمال می رود سیتریک اسید تولید شده توسط آسپرژیلوس نیجر از طریق جذب فلزاتی نظیر روی که برای تولید توکسین ضروری اند، به طور غیر مستقیم از تولید آن جلوگیری می نمایند. مکانیسم دیگر برای اثر مهارکنندگی آسپرژیلوس نیجر در تولید آفلاتوکسین، به تشکیل متابولیت ها و یا ترکیباتی نسبت داده می شود که در بیوستتز آفلاتوکسین مداخله می نمایند. تعدادی از حشره کش ها و علف کش ها می توانند مانع از رشد قارچ های آفلاتوکسین زا و تولید آفلاتوکسین توسط آنها شوند(مرتضوی و طباطبایی،1376.،اینگولد و هادسون،1997).
1-7- روش های سنجش آفلاتوکسین ها
روش های متنوعی جهت تشخیص وتعیین میزان آفلاتوکسین ها وجود درد .در اندازه گیری کمی وسنجش آفلاتوکسینM1 از روش های مختلف نظیر روش های کروماتوگرافی، اسپکتروفتومتری، بیولوژیکی و ایمونولوژیکی استفاده می گردد که در بخش های بعدی به برخی از آن ها اشاره می شود.
1-7-1- روش کروماتوگرافی میل ترکیبی
در این روش آنتی ژن یا آنتی بادی را از طریق گروه های آمین آزادشان ، به ذرات سفاروزی که با برومید سیانوژن فعال شده اند، متصل می کنند. اگر بخواهند آنتی ژن به خصوصی را از مخلوط آنتی ژن جدا نمایند، آنتی بادی را روی ذرات می نشانند واین انتی بادی های غیر محلول را در مجاورت مخلوط آنتی ژنی قرار می دهند. آنتی ژن های مربوطه جذب این آنتی بادی ها می شوند. سپس از طریق شستن ، سایر آنتی ژن های موجود در مخلوط آنتی ژنی را از محیط عمل دور می کنند و پیوند بین آنتی ژن وآنتی بادی را با اضافه کردن یون هایی نظیر تیوسیانات ، با تغییر pH از هم جدا می نند و به این ترتیب از مخلوط آنتی ژنی ، آنتی ژن خالص جدا می شود. بدیهی است که برای تخلیص آنتی بادی باید از آنتی ژن متصل به سفاروز استفاده کرد(مرتضوی و طباطبایی،1376).
1-7-2- روش کروماتوگرافی لایه نازک
برای مشاهده ترکیبات شناسایی شده حاصل از روش های کروماتوگرافی لایه نازک از اشعه فرابنفش یا واکنش شیمیایی که منجر به ایجاد نقاط رنگی می شود ، استفاده می گرد. این روش ها کیفی، ساده و نسبتاً سریع بوده و با استفاده از حلال می تونند بیش از یک نمونه را به طور همزمان آنالیز کنند.کمی کردن آن ها با انازه گیری دانسیته نقاط رنگی امکان پذیر است. آفلاتوسین ها وقتی در معرض نور فرابنفش با طول موج بالا قرار گیرند شدیداً فلورسانس می باشند. این خاصیت موجب می شود که این ترکیبات حتی در مقادیر بسیار جزئی مشخص شوند. از روش های کروماتوگرافی لایه نازک هم به منظور تشخیص و هم به منظور تعیین مقدار آفلاتوکسین M1 در شیر استفاده می شود. این عمل با یک استخراج مقدماتی همراه است که منجر به جداسازی آفلاتوکسین M1 در نمونه شیر می شود. علاوه بر این ، در این رو ش به آفلاتوکسین M1 استاندارد نیاز است که با لکه گذاری نمونه و استاندارد و مقایسه Rf و فلورسانس نقاط مربوط به نمونه و استاندارد، آفلاتوکسین M1 تشخیص داده شود و با استفاده از روش های دانسیتومتری ، مقدار آفلاتوکسین M1 موجود در نمونه تعیین گردد. کروماتوگرافی لایه نازک هم به صورت معمولی وهم به صورت دو بعدی جهت شناسایی آفلاتوکسین M1 استفاده شده و هیچ گونه اختلاف معنی داری بین میانگین و درصد بازیابی شده در این دو روش مشاهده نشده است. مقدار بازیابی شده در هر دو روش بیش از 87 درصد گزارش گردیده است(گاریدو و همکاران،2003).
1-7-3- روش کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا
از روش های کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا نیز به منظور تشخیص و تعیین مقدار آفلاتوکسین M1 استفاده می شود. ستون های مورد استفاده برای این منظور باید با توجه به ساختمان و قطبیت آفلاتوکسین M1 انتخاب شوند.آشکارساز مورداستفاده در این روش عموما از نوع فلورسانس می باشد که اساس کار آن بر پایه جذب طول موج خاص نور توسط ماده ونشر آن در طول موج معین به صورت فلورسانس می باشد(بنت و کیلچ،2003). در این روش برای تعیین مقدار آفلاتوکسین M1 نیاز به رسم منحنی استاندارد است که با تزریق مقادیر مشخص از محلول استاندارد آفلاتوکسین M1 با غلظت های مناسب به دستگاه ورسم ارتفاع پیک های حاصل در مقابل غلظت معین انجام می شود. سپس نمونه های استخراج شده از شیر به دستگاه و رسم ارتفاع پیک های حاصل در مقابل غلظت معین انجام می شود. سپس نمونه های استخراج شده از شیر به دستگاه تزریق شده و با استفاده از پیک های حاصل و مقایسه آنها نسبت به منحنی استاندارد ، غلظت این نمونه ها سنجیده می شود. درصورتی که نمونه مورد آزمایش دارای آفلاتوکسین M1 باشد پیک مشابهی با ماده استاندارد توسط دستگاه رسم خواهد شد. روش کروماتوگرافی مایع به کارایی بالا به دو صورت فاز نرمال و فاز معکوس انجام می شود. این روش بسیار دقیق بوده ، اما به تجهیزات پیشرفته و گران قیمت وافرادی متخصص نیازمند است(مرتضوی و طباطبایی،1376).
1-7-4- روش رادیو ایمونواسی
در این روش از سه جزء استفاده می کنند:
جزء اول آنتی ژنی است که با موادر ادیوکتیو، نشانه دار شده است، جزء دوم آنتی ژن غیر نشانداری است که باید تعیین غلظت گردد وجزء سوم مقدار مشخصی از آنتی بادی هایی است که با دو آنتی ژن مذکور وارد واکنش می شوند و معمولاً بر روی بستری ثابت شده است. بدیهی است که پس از مخلو ط کردن این سه جزء ، آنتی ژن های نشاندار وغیر نشانار با یکدیگر در اتصال به آنتی بای رقبت می کنند و هر آنتی ژن غیر نشاندار بیشتر باشد،آنتی ژن نشاندار کمتری وارد واکنش با آنتی بادی می گرد. پیشرفت های حاصله در نشاندار کردن آنتی ژن ، امکان اندازه گیری غلظت ایی از آنتی ژن د ر حد 10 تا 12 میکروگرم در میلی لیتر را فراهم نموده است(فوکال و بریزینا،1991).
1-7-5- روش ایمونورادیومتری
مقدار ماده نشانداری که در این روش استفاده می گردد خیلی بیشتر از مقدار به کار رفته در رادیوایمونواسی می باشد. در این روش آنتی بادی را بر روی ورقه سفتی نظیر پلاستیک ثابت می کنند و سپس آنتی ژن های محلول موجود در نمونه مورد آزمایش را در مجاورت آن قرار می دهند. پس از شست وشو، آنتی ژن های متصل به آنتی بادی های ثابت شده را از طریق مجاور ساختن با انتی بادی های ضد آن ها که توسط ماده ردیو اکتیو نشاندار شده اند، می سنجند. برای افزایش و دقت عمل می توان آزمون را در محیط جامع وبا استفاده از آنتی بادی های ویژه مناطق مختلف آنتی ژن انجام داد(فوکال و بریزینا،1991).
1-7-6- روش آنزیموایمونواسی
در روش آنزیموایمونواسی به جای مواد رادیو کتیو از آنزیم ها به عنوان مولکول نشانه در سنجش های ایمنی استفاده می کنند. اصولا از هر آنزیمی که دارای شرایط زیر باشد می توان در این روش بهره جست :
1. در دسترس بودن فرم خالص و ارزن قیمت آن
2. بالا بودن فعالیت ویژه آن.
3. دارابودن قابلیت اتصال به سایر مولکول ها بون از دست دادن فعالیت آنزیمی.
4. پایدار بودن کونژوگه آنزیمی.
5 . ترجیحا نبودن آن آنزیم در نمونه مورد سنجش.
6. ساده بودن سنجش فعالیت آنزیم مورد نظر وقابل اجرا بودن آن در آزمایشگاه های معمولی وغیر تشخیصی.
7. سمی وخطرناک نبودن هیچ کدام از اجزای واکنش انزیمی مانند آنزیم، سوبسترا وکوفاکتور(راستوگی و همکاران،2004).
1-7-7- روش های بیواسید
برای اثبات سمیت سنجش های بیولوژیکی ، ضروری هستند. عمومی ترین روش بیواسید تزریق 2/0 الی 1/0 میکوگرم از آفلاتوکسین به جنین تخم مرغ وسنجش میزان مرگ و میر در طی 23 روز فاز جوجه گیری می باشد(جی،1992).
از دیگر روش های بیولوژیک ، تغذیه جوجه اردک های یک روزه با این سموم و تعیین درجه پرولیفراسیون مجرای صفراوی می باشد. اخیرًا روش های ایمونولوژیکی با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال با تمایل بالا و حساس در جهت خالص سازی و تشخیص آفلاتوکسین M1 در شیر و محصولات لبنی به کار گرفته شده اند(جی،1992).
1-8- روش های حذف آفلاتوکسین ها
براي جلوگيري از ورود آفلاتوکسين M1از طریق شیر به زنجیره غذايي انسان، قبل از هر چيز بايد از ورود پيشساز آن يعني آفلاتوکسين B1 به خوراک دام هاي شيري جلوگيري نمود. چون انجام اين کار، بسيار مشکل و در حال حاضر تقريباً غيرممکن است، اقدام فوري تر و عملي تر، آن است که با اندازه گيري ميزان آفلاتوکسين M1در شير و فرآورده هاي آن از توزيع و مصرف لبنيات آلوده به مقادير بالاتر از حد مجاز اين سم در جامعه جلوگيري کرد. همچون بسياري از کشورها، در ايران نيز مقرراتي براي حداکثر مقدار مجاِز آفلاتوکسين M1 در محصولات لبني مختلف وضع شده است(ریاضی پور و همکاران،1389). حد مجاز آفلاتوکسین M1 در لبنیات ، 05/0(mcg/lit) است(گوربای و همکاران،2006).
(Gurbay et al,2006). برخی از پژوهشگران(2004) نشان دادند که از تعداد 223 نمونه انواع فراورده های شیری،90/58درصد آنها غلظت سم آفلاتوکسین بالای 05/0 پی.پی.اِم دارند(آسیسس و عبدالرحمان،2004).
استفاده از عوامل کلرینه کننده نظیر هیپوکلریت سدیم ، عوامل اکسید کننده مانند پراکسید هیدروژن (مرتضوی و طباطبایی،1376.، رحیمی و همکاران،2010) عوامل هیدرولیز کننده نظیر آمونیاک(بنت و کیلچ،2003)،انواع اسیدها مانند اسید استیک، بنزوئیک، سیتریک، لاکتیک، پروپیونیک و سوربیک(یوسفی،1369)، ترکیبات فنلی نظیر ارتووانیلین (مرتضوی و طباطبایی،1376)، آنتی بیوتیک ها مانند پیماریسین(حشمتی و میلانی،2010) آفت کش ها بویژه حشره کش ها وعلف کش ها نظیر دیکلروس، تری دکانون ها، سلنیت، نیترات، اتیلن، سدیم کلراید، پتاسیم کلرید و روش های بیولوژیکی(یوسفی،1369) از مهمترین روش های حذف آفلاتوکسین ها می باشند.
1-8-1- روش های بیولوژیکی
از مهمترین روش ها برای حذف آفلاتوکسین M1 می توان به استفاده از گرما ، سرما ، اشعه ماوراء بنفش ،مواد جاذب نظیر سیلیکاس ها، آلومینوسیلیکات و آلومیناس اشاره کرد. عوامل شیمیایی نظیر سولفیت سدیم ،ریبوفلاوین ،پراکسیدهیدروژن و سیستم لاکتوپرکسیداز نیز قابل ذکر هستند. ماکزیمم میزان آفلاتوکسین M1 در شیر و فراورده های آن طبق اتحادیه اروپا ، 50 نانوگرم در لیتر می باشد و نبایتی از این میزان تجاوز کند(رحیمی و همکاران،1391). استفاده از روش های بیولوژیکی نیز یکی از بهترین راهکارها برای کاهش تعداد مایکوتوکسین هایی مانند آفلاتوکسین و اکراتوکسین از بافت مواد غذایی نظیر شیر و فراورده های شیری می باشد(پیوتروسکا و زاکوسکا،2005).
درسال 1966، دانشمندان توانستند از میکروارگانیسم هایی مانند مخمرها ، کپک ها ، اکتینومیست ها ، باکتری ها ، خزه و جلبک ها جهت از بین بردن آفلاتوکسین استفاده نمایند.آسپرژیلوس نیجر مهمترین عامل رقابت کننده بیولوژیک در تولید آفلاتوکسین توسط آسپرژیلوس فلاووس می باشد. همزیستی آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس نیجر در غلات و حبوبات وسایر تولیدات کشاورزی به طور مکرر گزارش شده است. ریزوپوس نیز قادر به تجزیه و تخریب آفلاتوکسین ها می باشد. علاوه بر قارچ ها باکتری ها نیز ممکن است از طریق رقابت ،تولید آفلاتوکسین را متوقف ویا آن را متابولیزه وتبدیل به ماده ای با سمیت کمتر نمایند. برای مثال نوعی باکتری به نام فلاوباکتریوم اور آنتیکوم(B-184NRRL) می تواند سبب تخریب آفلاتوکسین در محیط کشت شود .عمل سم زدایی این میکروارگانیسم در محیط شیر ،روغن،ذرت، کره، بادام زمینی، سبوس وبادام به اثبات رسیده است(گاریدو و همکاران،2003).
بسیاری از مطالعات نشان داده که نژادهای باکتریایی و بیفیدوباکتریوم ها پتانسیل بالایی برای ایجاد اتصال با آفلاتوکسین ها دارند(اِ- نظامی و همکاران،1998). اخیراً لاکتوباسیلوس ها و باکتری های اسید لاکتیک توانایی خوبی را در بعضی از آزمایشات در سیستم های برون زیستی و درون زیستی از خود نشان داده اند(اِ- نظامی و همکاران،1998،1996). در مطالعه ای مشخص شد که باکتری های اسید لاکتیک توانایی مناسبی برای جلوگیری از رشد مایکوتوسین هایی نظیر اُکراتوکسین در محیط مایع را دارند(پیوتروسکا و زاکوسکا،2005).
گروهی از محققین(1993) نشان دادند که باکتری های اسید لاکتیک قادر به ایجاد پیوند با موتاژن ها در سیستم برون زیست هستند که میزان موتاژن جذب شده از روده کوچک موش های رت را کاهش دادند(بولوگنانی و همکاران،1997).
مکمل سازی شیر تخمیر شده با لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس موجب کاهش در میزان ترشح موتاژن کل در مدفوع و اوره در مقایسه با مصرف نمونه شیر کنترل گردید. اگر چه بسیاری از دانشمندان، فاکتورهای دیگری را نیز در امر اتصال باکتری ها و آفلاتوکسین و در نتیجه حذف این سموم دخیل می دانند(پلتونن و همکاران،2000).
به دلیل اثرات سمی آفلاتوکسین ها، راهکارهایی به منظور جلوگیری از رشد قارچ های تولید کننده مایکوتوکسین در مواد غذایی و جیره غذایی دام و طیور پیشنهاد شده است(کباک و همکاران،2006،2009). پیشنهاد شده که مکانیسم احتمالی اتصال باکتری ها به سموم قارچی نظیر آفلاتوکسین ها فرضیه ای مرتبط با دیواره سلول باکتری و پپتیدوگلیکان و پلی ساکاریدها می باشد و این دو ترکیب درحقیقت عامل اصلی اتصال مذکور هستند(بولوگنانی و همکاران،1997). آفلاتوکسین مستلزم ایجاد پیوند سموم به دیواره سلول های باکتریایی و یا ترکیبات دیواره سلول است(حاسکارد و همکاران،2001).
نشان داده شده که سطوح باکتری های پروبیوتیک نظیر بیفیدوباکتریوم و لاکتوباسیلوس رامنوزوسGG بطور مؤثری به آفلاتوکسین متصل می شود.گزارشاتی در دست است که اگزوپلی ساکاریدها و لایه پپتیدوگلیکان باکتری ها عامل مهمی در ایجاد این پیوند می باشد. از طرفی،باکتری لاکتوباسیلوس رامنوزوس در معرض تیمار آنزیمی قرار گرفت و اثر آن بر روی ایجاد پیوند با آفلاتوکسینB1 بررسی شد.نتایج نشان داد که هیچ شاهدی مبنی بر دخالت اگزوپلی ساکارید در این مورد وجود ندارد ولی پروتئین های دیواره سلول، یون های کلسیم و منیزیم نقش تعیین کننده ای در این باره نشان دادند. مطالعات بسیاری مشخص نموده که پپتیدوگلیکان دیواره سلول بخشی اساسی در ایجاد اتصال باکتری به مایکوتوکسین هاست(لاتینن و همکاران،2007).
نتایج برخی از مطالعات نشان داده است که گونه های پروبیوتیکی نظیر لاکتوباسیلوس رامنوزوسGG و لاکتوباسیلوس رامنوزوسGG نژاد LC-705 از باکتری های بسیار فعال در حذف آفلاتوکسین می باشند. این روش یکی از تکنیک های بیولوژیکی مؤثر است(اِ- نظامی و همکاران،2000). استفاده از سوش های پروبیوتیک در شیر مورد مصرف برای تولید فراورده های لبنی نظیر دوغ و ماست یکی از راهکارهای مفید در حذف آفلاتوکسین از این محصولات و نیز از دستگاه گوارش انسان می باشد(اِ- نظامی و همکاران،2000).
مشخص شده است که فلاوباکتریوم اورآنتیکوم در حرارت 28 درجه به مدت 12 ساعت ، قادر است تمامی آفلاتوکسین ها را در محیط کشت از بین ببرد. محیط حاوی کورینه باکتریم روبروم نیز آفلاتوکسین را تجزیه می کند. در تحقیقی استرپتوکوکوس لاکتیس به محیط حاوی آسپرژیلوس فالووس تلقیح شد .این عمل سبب گردید که سطح آفلاتوکسین به طور چشم گیری کاهش یابد. اثر لاکتوباسیلوس کازئی نیز بر رشد آسپرژیلوس و تولید توکسین توسط آن بررسی شد. نتایج حاصله نشان داد که مهار رشد در صورتی رخ می دهد که لاکتوباسیلوس کازئی و آسپرژیلوس پارازیتیکوس به طور همزمان کشت داده شوند و یا لاکتوباسیلوس قبل از افزایش کندی های آسپرژیلوس پارازیتیکوس تلقیح شود. از سوی دیگر ، چنانچه آسپرژیلوس پارازیتیکوس ابتدا رشد نماید وسپس لاکتوباسیلوس اضافه شود، هیچ مهاری در رشد و یا تولید آفلاتوکسین به چشم نمی خورد. نتایج مشابهی با استفاده از استرپتوکوکوس لاکتیس نیز به دست آمده است(مرتضوی و طباطبایی،1376.،گاریدو و همکاران،2003).
1-9- چربی شیر
شیر گاو ترکیبات اسید های چرب وسیعی دارد. اکثر اسید های چرب شیر، زوج کربنه و فاقد زنجیره جانبی هستند. اسید های چرب غیر اشباع، بیشتر به حالت سیس و انواع چند غیر اشباعی، عمدتا به صورت غیر کنژوگه دیده می شوند. در عین حال، مقادر جزئی از دیگر انواع اسید های چرب نیز در شیر یافت می شود، از جمله : اسید های چرب اشباع با تعداد کربن زوج یا فرد، خطی، تک یا چند شاخه ای، یک یا چند غیر اشباعی، شامل ایزومر های سیس، ترانس، کنژوگه و غیر کنژوگه.کتو اسید ها و هیدروکسی اسید ها نیز در شیر یافت می شوند.جدول 5-1 درصد وزنی ترکیبات اسیدهای چرب شیر را نشان می دهد.
اشباع درصد وزنی غیر اشباع درصد
اسید بوتیریک 2/3 اسید میریستولئیک 4/1
اسید کاپروئیک 2 اسید پالمیتولئیک 7/2
اسید کاپریلیک 2/1 اسید اولئیک 8/27
اسید کاپریک 8/2 اسید لینولئیک 4/1
اسید لوریک 5/3 اسید لینولنیک 5/1
اسید میریستیک 2/11 اسید پالمیتیک 26 اسید استئاریک 2/11 1-9-1- اثر چربی ها و اسیدهای چرب شیر روی باکتری های اسید لاکتیک (با توجه ویژه به دو گونه لاکتوباسیلوس و استرپتوکوکوس)
یکی از ویژگی های باکتری های اسید لاکتیک (LAB) نیاز آن ها به رنج وسیعی از فاکتورهای رشد است مثل ویتامین های متعدد و واحدهای اساسی سازنده اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها. در نتیجه وقوع LAB در طبیعت با نیاز بالای آن ها به مواد مغذی مرتبط است. زیستگاه طبیعی LAB گیاهان سالم و فاسد، شیر و روده پستانداران و غشاهای مخاطی است. گونه های LAB تفاوت بسیار زیادی در توانایی خود در تخمیر قندهای مختلف و سایر منابع کربنی دارند. لاکتوباسیلوس دلبروکی یکی از سخت ترین گونه های LAB در ارتباط با این موضوع است. از طرف دیگر ال. دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس و لاکتیس به طور گسترده ای به عنوان آغازگر همراه با استرپتوکوکوس ترموفیلوس به خصوص در صنایع لبنی برای تولید (به ترتیب) ماست و پنیرهای سخت نوع سوئیسی به کار می روند.
تعداد بسیار محدودی اطلاعات منتشر شده در مورد نقش اسیدهای چرب و چربی ها به عنوان فاکتورهای ضروری رشد برای LAB وجود دارد. محیط کشت استاندارد MAR که برای کشت غیرانتخابی لاکتوباسیلوس ها به کار می رود حاوی 1/0% (w/v) توئین 80 است، مشتق محلول در آب از اسید اولئیک (سیس-9 اکتادسنوئیک اسید) که به عنوان افزایش دهنده رشد بسیاری از LAB ها شناخته شده است. علاوه بر این، بسیاری از LAB رشد کرده در محیط کشت حاوی توئین 80، اسید اولئیک را به غشای خود اضافه کرده و بیشتر آن را به اسیدهای چرب سیکلو پروپان و اسیدهای چرب خاص تبدیل می کنند، به ویژه در لاکتوباسیلوس ها (اولیری و ویلکینسون، 1988).
اهمیت اسیدهای چرب سیکلوپروپان در غشای لاکتوباسیلوس ها به سختی قابل درک است، اما آن ها بر این باورند که وجودشان برای افزایش سیالیت غشا مثل اسیدهای چرب چند غیراشباع است و برای حفاظت LAB از اثرات جانبی زیست محیطی مثل درجه حرارت شدید، pH کم، اثرات زیان بار اکسیژن و ورود به فاز رشد ثابت (اسمیت و همکاران، 1972؛ جکویس و هانت، 1980؛ جکویس، 1981؛ ساتاری و لاکسو، 1992). از طریق درک عمیق از متابولیسم اسید چرب در ال. دلبروکی ممکن است زنده مانی و رشد و به علاوه خواص فیزیولوژیکی و تکنولوژیکی این باکتری آغازگر را به ویژه در شیر که غنی از چربی ها (حدود 5/3-5/4%) و عمدتا تری گلیسیریدها می باشد را بهبود دهد.
پرتانن و همکاران در سال 2001 اثر چربی ها و اسیدهای چرب روی رشد شش گونه لاکتوباسیلوس دلبروکی با استفاده از محیط کشت MRS براث تغییریافته بدون توئین80 به عنوان محیط کشت پایه رشد مورد مطالعه قرار دادند. از بین گونه های بررسی شده همه به جز یک سویه توئین 80 یا توئین 20 به عنوان مکمل اسید چرب برای رشد نیاز داشتند. توئین 40 و توئین 60 که حاوی تنها اسیدهای چرب بلند و متوسط زنجیره است، رشد همه گونه های ال. دلبروکی را مهار می کند هنگامی که به عنوان تنها مکمل چربی در محیط MRS براث وجود دارد. اسید اولئیک آزاد می تواند مکمل توئین 80 یا توئین20 را جایگزین کند (اما این موضوع در مورد اسید لوریک صدق نمی کند) که از این مطلب می توان برداشت کرد که اسیدهای چرب فاکتورهای رشد اساسی برای بیشتر گونه های لاکتوباسیلوس دلبروکی هستند. در میان روغن های طبیعی مورد آزمایش قرار گرفته، روغن های حاوی کمترین میزان اسیدهای چرب بلند زنجیر رشد ال. دلبروکی را به طور بسیار موثری بهبود بخشیدند. به خصوص اسیدهای چرب سیکلوپروپان 19C و 18:1C سلولی ال. دلبروکی به شدت تحت تاثیر ترکیبات اسید چرب اگزوژنوس (برون زا = اسیدهای چربی که خارج سلولی هستند)، تنوع ژنتیکی گونه های پیشنهادی، پلی مورفیسم در میان ژن های کد شده و یا تنظیم سنتز سیکلوپروپان، قرار گرفتند. به علاوه بدیهی است که شاید نه همه ی گونه های ال. دلبروکی ولی بیشتر گونه های آن فاقد سنتتاز خاص هستند، به فعالیت های دسچورازی (desaturase) و دهیدرازی برای سنتز دوباره اسیدهای چرب غیراشباع بلند زنجیر نیاز دارند. این ویژگی های بیوشیمیایی می توانند به عنوان خواص کموتاکسونومیک آموزنده ای برای شناسایی و انتخاب گونه آغازگر ال. دلبروکی باشند (پرتانن و همکاران، 2001).
تومارلی و همکاران (1950) اثر اسیدهای چرب را بر رشد گونه های لاکتوباسیلوس بیفیدوس مورد مطالعه قرار دادند.آن ها گزارش کردند که اسیدهای چرب شیر انسان و گاو که توسط پانکراتین هضم شده و آزاد شده اند جلوی رشد گونه های میله ای شکل و بیفید لاکتوباسیلوس بیفیدوس جدا شده از مدفوع نوزادان شیرخوار را می گیرد. از اسیدهای چرب اشباع آزمایش شده، اسید لوریک و اسید میریستیک سمی ترین مهارکننده هر دو گونه باکتری بودند. اسید اولئیک و اسید لینولئیک اثر بازدارندگی روی رشد گونه های بیفید را دارند اما چنین اثری را روی گونه های میله ای شکل (در محیط حاوی بافر استات سدیم) نشان ندادند. هنگامی که استات در محیط با سدیم سیترات جایگزین شد، هر دو گونه باکتری برای رشد خود نیاز به منبع اسید چرب غیراشباع داشتند و برای هر دو گونه اسید اولئیک آزاد نقش بازدارندگی داشت. شیر گاو شیر انسان و آب پنیر دیالیزشده در میان سوبستراها حاوی فاکتورهایی هستند که قابلیت لغو کردن سمیت اسیدهای چرب برای گونه های ال. بیفیدوس را دارند (تومارلی و همکاران، 1950).
تان و همکاران در سال 2011 گزارش کردند که رشد بهینه لاکتوباسیلوس کازئی در سیستم رساندن (ripening) پنیر چدار نیازمند اسیدهای چرب اگزوژنوس (برون زا) هستند. آن ها همچنین نشان دادند که افزودن توئین80 به عصاره پنیر چدار منجر به افزایش قابل توجه در دانسیته سلولی نهایی ال. کازئی در طول رشد در دمای 8 درجه سانتیگراد شده است و تغییرات همزمانی در ترکیبات اسیدهای چرب غشای سیتوپلاسمی ایجاد کردند. اگرچه اثر آن در مقایسه با افزودن چربی شیر یا مخلوط مونوآسیل گلیسرول بر پایه خصوصیات مونوآسیل گلیسرول چربی شیر به عصاره پنیر چدار چندان چشمگیر نبود و در دومی افزودن ترکیبات مذکور منجر به افزایش دانسیته سلولی نهایی ال. کازئی در عصاره پنیر چدار در 8 درجه سانتیگراد و تغییرات در ترکیبات اسیدهای چرب غشای سیتوپلاسمی شد. این مشاهدات نشان می دهد که رشد بهینه ال. کازئی در عصاره پنیر چدار در دمای پائین نیازمند غنی شدن با یک منبع اسیدهای چرب است. آن ها این طور فرض کردند که ال. کازئی اسید چرب محیطی را به اسیدهای چرب غشای سیتوپلاسمی خودش اضاغه می کند، در نتیجه انرژی مورد نیازش برای رشد را کاهش می دهد. اسید چرب اگزوژنوس (برون زا) پس از آن ممکن است تغییر کند یا همراه با اسید چرب حاصل از دوباره سنتز شدن به ترکیبات اسیدهای چرب غشای سیتوپلاسمی ضمیمه شوند که عملکرد (مثل ویسکوزیته) مورد نیاز رشد در شرایط خاص را بهبود می بخشد (تان و همکاران، 2011).
همان طور که مشخص است تحت شرایط خاص اسیدهای چرب به طور قابل توجهی رشد باکتری های اسید لاکتیکی را تحت تاثیر قرار می دهند. در سنجش های میکروبیولوژیکی ریبوفلاوین و اسید پانتوتنیک، تحریک خاص ارگانیسم مورد مطالعه، لاکتوباسیلوس کازئی، نتایج حاصل حضور مقادیر کم لستین یا اسیدهای چرب را نشان دادند به هنگامی که این ویتامین ها در مقدار کمتر از حد مطلوب (کمتر از حد بهینه) وجود دارند (بایورفیند و همکاران، 1942؛ استرانگ و کارپنتر، 1942). در سطوح بالاتر از مواد چرب ممکن است اثر بازدارندگی ایجاد شود. اثر مشابه مواد چرب در سنجش های اسید پانتوتنیک با لاکتوباسیلوس آرابینوس مشاهده شده است (اسکجز و رایت، 1944).
همچنین مشاهده شده است که حضور اسید اولئیک، روغن برنج و یا یک ماده محلول در چربی از مواد طبیعی ناشناخته حاصل از خون نیاز لاکتوباسیلوس کازئی را به بیوتین برطرف می کند (ویلیام و فیجر، 1946). همچنین اسید اولئیک از بسیاری جهات عمل بهبود تولید استات را برای رنج وسیعی از لاکتیک اسید باکتری ها تکثیر می کند (گویرارد، 1946).
برای گونه های لاکتوباسیلوس بولگاریکوس تست شده، اولئیک اسید، هرچند ضروری برای رشد است به طور کلی سمی است که عمل بهبود رشد می تواند تنها در یک محدوده باریک (محدود) از غلظت ها و pH مشاهده شود. علاوه بر عوامل امولسیون کننده محلول در آب خاص و عوامل کاهش دهنده کشش سطحی مثل توئین40 که توسط خودشان غیرفعال می شوند اولئیک اسید را غیرسمی می کنند و به طور گسترده ای محدوده pH را گسترش می دهند که در آن فعالیت مشاهده می شود. توئین80 که یک استر محلول در آب اولئیک اسید است یک منبع عالی و غیرسمی اسید اولئیک برای استفاده در محیط کشت برای این ارگانیسم ها است.
بسیاری از باکتری های اسید لاکتیک مهمولا به عنوان میکروارگانیسم های مورد سنجش استفاده می شوند که به اسید اولئیک برای رشد در محیط کشت کامل نیاز ندارند. اگر بیوتین حذف شود، با این حال، اسید اولئیک برای رشد ضروری است. اثربخشی اسید اولئیک در این زمینه تا حد زیادی با حضور همزمان توئین40 افزایش یافته است. توئین80 در مقادیر کافی اثر مشابه با توئین40 به اضافه اسید اولئیک دارد. عمل بهبود رشد اسید اولئیک تحت این شرایط با آویدین بیشتر در محیط از بین نمی رود، آن چنان که با بیوتین از بین می رود. گفته می شود که یک عمل بیوتین کاتالیز سنتز اسید اولئیک است هنگامی که دومی در محیط های کمپلکس این طور تغذیه شدند، بیوتین غیرضروری می شود (ویلیام و همکاران، 1947).
کاستیلو و اسپک (1951) در تلاش برای تعیین علت خواص بازدارندگی شیر رنسید شده بر روی استرپتوکوکوس لاکتیس، همه اسیدهای چرب معمول در چربی شیر را برای اثرشان روی رشد ارگانیسم مورد آزمایش قرار دادند. اسیدهای کاپریلیک، کاپریک و لوریک رشد اس. لاکتیس را مهار کردند، درجه مهارکنندگی با افزایش غلظت اسید افزایش یافت. اثر اسید میریستیک نامعلوم بود، و هیچ کدام از اسیدهای آزمایش شده دیگر باعث مهار رشد این ارگانیسم نشدند. این خواص مهارکنندگی شیر رنسید شده و مشاهده شده در شیر حاوی اسیدهای چرب ناشی از کشش سطحی کم شیر نیست، اما ناشی از برخی اثرات سمی غیر قابل توصیف اسیدهای چرب اختصاصی است (کاستیلو و اسپک، 1951).
ویلت و مورس (1966) اثر مهار کنندگی اسیدهای چرب بلند زنجیر را روی رشد استرپتوکوکوس آگلاکتیه در محیط کشت شیمیایی خاص مورد مطالعه قرار دادند. منظور از فعالیت اسیدهای چرب وابسته است به این که آیا مهار کنندگی کامل است یا پاسخ متوسط (50% نقطه مهارکنندگی) به عنوان یک پارامتر فعالیت مورد استفاده قرار گرفت. وقتی که مهرکنندگی کامل رشد به عنوان معیار استفاده شد، درجه غیراشباعیت اسیدهای 18C فعالیت ضد میکروبی را افزایش داد. با این حال، وقتی پاسخ متوسط به عنوان یک اندیس استفاده شد، این روند برعکس شد. افزایش در زنجیر کربن از 12C به 18C با نقاط مهارکنندگی کامل یا پاسخ متوسط مرتبط نبود. خاصیت ضد میکروبی اسیدهای چرب اشباع و غیراشباع با آلبومین سرم گاوی و سایر ترکیبات، یک عمل باکتریواستاتیکی (متوقف کننده رشد باکتری) را نشان می دهد (ویلت و مورس، 1966).
1-10- ماست
ماست یک محصول تخمیر شده لبنی است که از تخمیر شیر به وسیله استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس بدست می آید(سایتو،2004.،کراساکوپت و همکاران،2008).
شیرهای تخمیری نظیر ماست از این جنبه با پنیر متفاوتند که در تولید آنها آنزیم رنین مورد استفاده قرار نمی گیرد و حالت قوام ایجاد شده در آنها ناشی از اسیدی شدن شیر توسط باکتریهای اسید لاکتیک است. ماست امروزه رایج ترین و پرمصرف ترین محصول لبنی تخمیری است(کورانا و کاناوجا،2007.فکریتندن و همکاران،2005).
فعال سازی هضم گلوسیدها و پروتئین ها، سنتز گروه های ویتامین B و ویتامین K، اسیدهای مختلف و لذا جلوگیری از گسترش فعالیت پاتوژن ها، سنتز آنتی بیوتیک ها، جلوگیری از انواع سرطان ها، توقف رشد دیسانتری، تولید دوباره باکتری های فلور روده ای در طول و بعد از درمان با آنتی بیوتیک، بهبود اگزمای پوستی، بهبود زخم ها، تسکین پوست، کمک به مشکلات گاستروانتریت، جبران کمبود ویتامین ها، رفع مشکل هضم لاکتوز در افراد مبتلا به عدم تحمل لاکتوز، رفع حساسیت های مربوط به شیر، کاهش استرس و اضطراب، بهبود هپاتیت، آنفلوآنزا، سرخک، صرع، تشنج و دیفتری ، افزایش جذب فیبرها و تقویت حافظه از مزایای استفاده از ماست می باشد(اَل ـ وابل و همکاران،2008.،هارلی و همکاران،2008).
1-11- دوغ
دوغ يك نوشيدني ايراني بر پايه لبنيات است كه در بیشتر موارد در مقياس صنعتي از ماستي كه دارای اسيديته بالايي است، تهيه مي گردد. مدت نگه داري اين محصول یک ماه بوده، در نخستین روزهای تهیه، به دلیل pH پائین پائين دو فاز مي شود(عباسی و همکاران،1388). دوغ از رقیق کردن ماست با آب آشامیدنی، معدنی یا آب پنیر تخمیر شده و یا دوغ کره بدست می آید. تولید و مصرف این فراورده لبنی در ایران و در کشور ترکیه به نام آیران مرسوم بوده است. دوغ ممکن است به صورت بدون چربی یا چربی دار و نیز بدون گاز یا گاز دار باشد(حصاری و منافی،1389). البته لازم به ذکر است که نوع دیگري از دوغ هم به طور سنتی در ایران و برخی کشورها با تخمیر آب کره تولید می شود که از طعم و مزه بسیار مناسبی برخوردار است و طرفداران زیادي هم دارد، هر چند این نوع فرآورده ها در مقیاس غیرصنعتی و در حد کارگاهی در کشور تولید و به مصرف می رسند ولی بیش تر کارخانه هاي تولیدکننده فرآورده هاي شیري به دلیل به کارگیري آب کره در استاندارد کردن شیر پاستوریزه رغبت چندانی به تولید این نوع فرآورده ها ندارند. این گونه فرآورده ها در سایر کشورها از جمله ترکیه، بلژیک، دانمارك، هند، آمریکا و هلند هم مصرف داشته و از آن تحت عنوان هایی مانند Ayran ،Acid milk drink ،Yoghurt drink نام برده می شود(فرخنده و همکاران،1967).
فصل دوم:
سابقه و پیشینه تحقیق
2-1- مروری بر تحقیقات پیشین
مطالعات مختلف نشان می دهد که سطح آفلاتوکسین شیر دارای نوسان می باشد بطور مثال کامکار و همکاران با بررسی فصلی آلودگی آفلاتوکسین M1 در شیر نشان داد که میانگین آفلاتوکسین M1 در نمونه های پاییز و زمستان بطور معنی داری بیشتر از نمونه های بهار وتابستان می باشد. در بررسی شیرهای استان گیلان که توسط دکتر مهسا تبری و دکتر امین افشار صورت گرفت، میزان آفلاتوکسین بطور متوسط 73/1 ± 91/74 مشاهده شد. برای تعیین بیشترین ناحیه آلوده و وجود یا عدم وجود تفاوت در میزان آفلاتوکسین، داده های هر ناحیه با ناحیه دیگر با آزمون ANOVA مقایسه گردید. نتایج حاصل از این آزمون ها نشان داد که تفاوت معنی داری در میزان آلودگی در نواحی مختلف وجود دارد و بر مبنای آن میزان آلودگی در دو ناحیه به طور معنی داری(01/0p>) بالاتر از سایر نواحی است. این بالاتربودن آلودگی، می تواند به میزان رطوبت بالاتر در این مناطق نسبت داده شود. هرچند 80 درصد نمونه های شیر آفلاتوکسین بالاتری از حد مجاز ng/l50 آفلاتوکسین M1 اتحادیه اروپا داشتند. میزان آلودگی به آفلاتوکسین کمتر از حد حداکثر استاندارد میزان آلودگی آمریکا ( µg/l5/0) است. کمترین میزان آلودگی ng/l 19 و بیشترین میزان آلودگی 128 نانوگرم بر لیتر ارزیابی گردید که کمتر از حد کدکس الیمنتاریوس و استاندارد ملی ایران(ng/l 500) بود(کامکار و همکاران،2005).
رحیمی و همکاران(2010) نیز دریافتند که میزان آلودگی شیر خام عرضه شده در اهواز که شامل نمونه های شیر خام گاو ، شتر ، گوسفند بز می شد، بالغ بر 1/42 درصد بود(رحیمی و همکاران،2010).
تحقیقات انجام شده توسط برخی از محققین بر روی62 نمونه شیر فرادما در مشهد به روش الایزا نشان داد که 100 درصد نمونه های مورد مطالعه به آفلاتوکسین M1 آلودگی داشتند. میانگین غلظت آلودگی بین 22 تا 389 نانوگرم در کیلوگرم بود. در 6/80 درصد نمونه ها میزان آلودگی بیش از حد مجاز تعیین شده به وسیله اتحادیه اروپا گزارش گردید(محسن زاده و بیسجردی،1384). محسن زاده و هکاران (1385) در مطالعه دیگری نشا دادند که 4/80 درصد نمونه های پنیر سنتی وفتای تولید شده در مشهد به آفلاتوکسین M1 آلوده بودند. میانگین غلظت آلودگی در پنیرهای سنتی فتا به ترتیب 399/0 و 384/0 میکروگرم در کیلوگرم بود. بالاترین میزان غلظت آلوگی در نمونه های جمع آوری شده در ماه های بهمن و اسفند(381/0 میکروگرم در کیلوگرم) مشاهده شد.
فلاح و همکاران(2009) در مطالعه ای بر روی پنیر سفید ایرانی وپنیر خامه ای در 6/76 درصد نمونه های پنیر سفید ایرانی و1/80 درصد پنیر خامه ای آلوگی به آفلاتوکسین را تشخیص دادند. میزان آلودگی 1/52 نانوگرم در کیلوگرم تا 4/785 نانوگرم در کیلوگرم متغیر بود که در 4/28٪ نمونه های پنیر سفید ایرانی و1/19 درصد پنیر خامه ای میزان آلودگی بیش از حد مجاز استاندارد اتحادیه اروپا برسد(فلاح و همکاران،2009). در مطالعه دیگری که توسط فلاح(2010) بر روی شیر پاستوریزه و فرادمای عرضه شده در مناطق مرکزی ایران انجام شد، مشخص گردید که آفلاتوکسین M1 در 1/67 درصد نمونه های شیر پاستوریه و 3/62 درصد نمونه های شیر فرادما وجود داشت(فلاح و همکاران،2010).
در مطالعه دیگری که توسط کامکار(1381) بر روی 64 نمونه از شیر های فرادمای عرضه شد در تهران به روش TLC انجام شد مشخص گردید که 53 نمونه (6/82 درصد) از نظر وجود آفلاتوکسین M1 مثبت و 11 نمونه (4/17 درصد) منفی و میزان آلودگی در محدوده ی بین 387-69 نانوگرم در لیتر بود.
در مطالعه انجام شده توسط کریم و همکاران(1378) بر روی 73 نمونه شیرهای تحویل شده به کارخانجات شیر پاستویزه تهران از نظر وجود آفلاتوکسین M1 به روش الایزا از مجموع نمونه های آزمایش شده 13 مورد(8/17 درصد) بدون آلودگی به سم وتعداد 60 نمونه (8/82 درصد) آلوده به آفلاتوکسین M1 به میزانی بیش از حد مجاز استاندارد مورد استفاده در اتحادیه اروپا یعنی 50 نانوگرم در لیتر بوند.گزارش های موجود نشان می دهد که چنانچه هدف تولید شیرهایی با آلودگی کمتر از 50 نانو گرم در لیتر آفلاتوکسین باشد، باید بر روی جیره غذایی مورد مصرف دام ها دقت زیادی اعمال گردد تا مقدار آلودگی به آفلاتوکسین های BوG بیش از 2 تا 3 میکرو گرم در هر کیلو گرم نباشد.
در بررسي ديگري كه توسط ساريمه متوقلو و همکاران انجام گرفت توانايي جذب آفلاتوكسين M1 توسط باكتري هاي ماست مورد تحقيق قرار گرفت. نتايج نشان داد كه توانايي جذب آفلاتوكسين M1 شير توسط لاكتوباسيلوس دلبروكي زيرگونه بولگاريکوس 5/27 درصد و استرپتوكوكوس ترموفيلوس 39/16 درصد است و مقدار آفلاتوكسين M1 جذب شده در ماست حداقل 2/14 درصد است. این یافته ها حاکی از آن است که باکتری های آغازگر ماست می توان برای حفاظت شیر در برابر آفلاتوکسین M1 پیشنهاد کرد(ساری مهمتوگلو،2004).
